一种草酸和柠檬酸检测用的衍生试剂、液相色谱检测方法以及试剂盒

本发明涉及分析检测，尤其涉及一种草酸和柠檬酸检测用的衍生试剂、液相色谱检测方法以及试剂盒。

背景技术：

1、草酸钙是最常见的结石，主要是由于体内钙和草酸水平之间的不平衡和或缺乏足够的结晶抑制剂而形成的。尿草酸过多或高草酸尿症的原因可根据病因和临床表现的严重程度分为原发性(罕见)和继发性(常见)高草酸尿症。草酸的检测主要有液相色谱法、液相色谱质谱法、显色试纸法和离子色谱法等。

2、柠檬酸盐是钙盐结晶的强效抑制剂。柠檬酸钾治疗对原发性或继发性低柠檬酸尿症和酸化障碍患者有效。低柠檬酸尿症被认为是肾结石形成的原因。柠檬酸的检测主要有液相色谱法，液相色谱质谱法等。

3、目前，有关草酸、柠檬酸检测的方法有很多，但为了提高检测效果，多是以液相色谱-串联质谱法检测，不仅前处理过程复杂、耗时较多，且会增加检测的成本。比如专利cn104101679a以及文献《高效液相色谱法测定血和尿中的草酸》(张惠静,张世德,任建敏等.第三军医大学学报,1997(01):91-92.)等，以邻苯二胺和浓盐酸作为衍生试剂，与血和尿中草酸在高温条件下反应生成具有强紫外吸收化合物2，3-二羟基喹喔啉，而后通过反相柱分离，从而进行血和尿中草酸的测定，上述方法不仅反应时间长，而且反应条件苛刻，需要在高温条件下进行。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明偶然发现，在检测草酸和柠檬酸时，衍生试剂中引入碳二亚胺类化合物，可以显著缩短衍生化时间，且衍生条件更温和，在常温下即可成功实现衍生化。但后续发现，并非所有的碳二亚胺类化合物都能助益衍生化反应，当所述碳二亚胺类化合物中r和r’为未被取代的c1～c7的烷基时，甚至不能成功实现衍生化。后续经过大量研究后，本发明发现，这与衍生试剂的溶剂中有机溶剂的含量有关。

2、具体地，本发明具有如下技术方案：

3、第一方面，本发明首先提供一种草酸和柠檬酸检测用的衍生试剂，包括衍生试剂a、衍生试剂b和溶剂；所述衍生试剂a包括含有氨基的芳香化合物；所述衍生试剂b包括碳二亚胺类化合物；所述溶剂包括有机溶剂；

4、所述碳二亚胺类化合物的结构式为r-n＝c＝n-r’，r和r’相互独立、相同或不同地代表未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基、未被取代的c3～c7的环烷基、被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基；

5、所述胺基包括r1-nh2、r2-nhr3或r4-nr5r6，其中r1～r6代表相互独立、相同或不同地代表未取代的c1～c3的烷基。

6、当所述r和/或r’为被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～100vol％；

7、当所述r和r’为未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基或未被取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％。

8、本发明发现，所述碳二亚胺类化合物在引入时，需要根据不同的取代基优化有机溶剂的含量，通过优化衍生试剂中有机溶剂的含量能够在相对较低的温度下实现高效衍生，前处理条件更温和，衍生化的效率更高。

9、本发明中，烷基可以是被胺基取代的烷基，也可以是未取代的烷基，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代；优选地，当被取代时，烷基中的氢原子被所述胺基取代。

10、本发明中，胺基可以是一级胺(r1-nh2)、二级胺(r2-nhr3)或三级胺(r4-nr5r6)，其中r1～r6代表相互独立、相同或不同地代表未取代的c1～c3的烷基，可以是甲基、乙基或丙基。

11、本发明中，c1～c7的烷基包括c1～c7的直链烷基以及c3～c7的支链烷基，具体可以是甲基：-ch3、乙基：-ch2ch3、丙基：-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、正丁基：-ch2ch2ch2ch3、异丁基：-ch2ch(ch3)2、叔丁基：c(ch3)3、正戊基：-ch2ch2ch2ch2ch3、异戊基：-ch2ch2ch(ch3)2、新戊基：-c(ch3)3、叔戊基：-ch2c(ch3)3、正己基：-ch2ch2ch2ch2ch2ch3、异己基：存在多种异构体；如-ch2ch2ch2ch(ch3)2、叔己基：存在多种异构体，如-c(ch3)2ch2ch3、正庚基：-ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch3、支链庚基的异构体非常多样，如：2-甲基己基：-ch2ch2ch(ch3)ch2ch2ch3、3-甲基己基：-ch2ch2ch2ch2ch(ch3)2、叔庚基：-c(ch3)2ch2ch2ch3以及其他多种可能的支链结构。

12、本发明中，c3～c7的环烷基可以包括环丙基：-c3h5、环丁基：-c4h7、环戊基：-c5h9、甲基环丁基：-ch2c4h7、环己基：-c6h11、甲基环戊基：-ch2c5h9、环庚基：-c7h13、甲基环己基：-ch2c6h11等。

13、本发明中，当所述r和r’为未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基或未被取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％中的任一数值；例如80vol％、82vol％、84vol％、86vol％、88vol％、90vol％、92vol％、94vol％、96vol％、98vol％、或100vol％等数值。

14、本发明中，当所述r和r’为未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基或未被取代的c3～c7的环烷基时，衍生试剂中dmso的含量为80～100％的范围内，该衍生试剂仍可以在低于现有技术的衍生温度下以较高的效率完成衍生，但检测灵敏度随着有机溶剂含量的降低而降低。也就是说，当所述r和r’为未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基或未被取代的c3～c7的环烷基时，衍生试剂中dmso的含量(在80～100％的范围内)越高，检测灵敏度越高。

15、本发明中，当所述r和/或r’为被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～100vol％的范围内均可以成功实现衍生化反应，且不同含量的有机溶剂对于检测灵敏度的效果相当。

16、本发明中，当所述r和/或r’为被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量可以为40～100vol％中的任一数值；例如40vol％、45vol％、50vol％、55vol％、60vol％、65vol％、70vol％、75vol％、80vol％、85vol％、90vol％、95vol％或100vol％等数值。

17、优选地，出于成本等考虑，可以将溶剂中的部分有机溶剂替换为水，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～50vol％就可以成功实现衍生化反应；例如40vol％、41vol％、42vol％、43vol％、44vol％、45vol％、46vol％、47vol％、48vol％、49vol％或50vol％等数值。

18、优选地，所述碳二亚胺类化合物的结构式为r-n＝c＝n-r’，r和r’相互独立、相同或不同地代表被胺基取代的c1～c7的直链烷基或被胺基取代的c3～c7的支链烷基。

19、优选地，所述碳二亚胺类化合物的结构式为r-n＝c＝n-r’，r和r’相互独立、相同或不同地代表未被取代的c2～c6的直链烷基、未被取代的c3～c6的支链烷基、未被取代的c3～c6的环烷基、被胺基取代的c2～c6的直链烷基、被胺基取代的c3～c6的支链烷基或被胺基取代的c2～c6的环烷基。

20、本发明中，所述芳香化合物可以包括苯基、苄基或萘基等；所述含有氨基的芳香化合物可以是被一个氨基取代的苯、苄或萘，也可以是被两个氨基取代的苯或萘，优选地，上述两个氨基为邻位取代。

21、优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙腈、异丙醇和二甲基甲酰胺中的一种或几种。

22、优选地，所述衍生试剂a包括苯胺、邻苯二胺、苄胺、2-氨基萘和2,3-二氨基萘中的一种或几种；进一步优选地，所述衍生试剂a包括邻苯二胺。

23、优选地，所述衍生试剂b中，当烷基被胺基取代时，所述胺基中的r1～r6代表甲基。

24、优选地，所述衍生试剂b中碳二亚胺类化合物包括二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、二叔丁基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、1-叔丁基-3-环戊基碳二亚胺、二异己基碳二亚胺和1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种。

25、本发明中，二环己基碳二亚胺的结构式为

26、二异丙基碳二亚胺的结构式为

27、二叔丁基碳二亚胺的结构式为

28、1-叔丁基-3-环戊基碳二亚胺的结构式为

29、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺的结构式为

30、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的结构式为

31、优选地，所述衍生试剂b中，当碳二亚胺类化合物为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺时，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～100vol％；更优选地，所述溶剂中所述有机溶剂的含量为40～50vol％。

32、优选地，所述衍生试剂b中，当碳二亚胺类化合物为二叔丁基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-叔丁基-3-环戊基碳二亚胺、二异己基碳二亚胺和1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种时，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％。

33、作为本发明的一种优选实施例，所述衍生试剂a包括邻苯二胺，所述衍生试剂b包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，所述溶剂由水和有机溶剂组成，所述溶剂中所述有机溶剂的含量为40～50vol％。

34、本发明发现，当所述衍生试剂中衍生试剂a包括邻苯二胺，衍生试剂b包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺时，可以进一步提高检测灵敏度，同时反应衍生效率更高且衍生产物更加稳定；且能够大大降低溶剂中有机溶剂的含量。

35、或，作为本发明的一种优选实施例，所述衍生试剂a包括邻苯二胺，所述衍生试剂b包括二叔丁基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-叔丁基-3-环戊基碳二亚胺、二异己基碳二亚胺和1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种，所述溶剂由水和有机溶剂组成，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％。

36、作为优选，所述含有氨基的芳香化合物和所述碳二亚胺类化合物的质量比为(100～300)：(100～300)；更优选为(180～220)：(200～300)。

37、本发明中，在配制所述衍生试剂时，本领域技术人员可以先将衍生试剂a溶解在溶剂中，再将衍生试剂b溶解在溶剂中，而后将衍生试剂a的溶液与衍生试剂b的溶液混合，得到衍生试剂；也可以直接将衍生试剂a、衍生试剂b和溶剂直接进行混合。

38、第二方面，本发明提供一种液相色谱检测草酸和柠檬酸的试剂盒，包括所述的衍生试剂。

39、优选地，所述试剂盒中还包括待测样品和酸化剂；所述待测样品包括检测样本、校准品和质控品中的至少一种；所述检测样本包括血液或尿液。

40、优选地，所述检测样本包括人血液或人尿液；进一步优选地，所述检测样本为人尿液。

41、作为优选，所述校准品中草酸的浓度范围为10～250μg/ml；所述质控品中草酸的浓度范围为30～175μg/ml。

42、作为优选，所述校准品中柠檬酸的浓度范围为40～1000μg/ml；所述质控品中柠檬酸的浓度范围为120～700μg/ml。

43、第三方面，本发明提供所述衍生试剂在液相色谱检测草酸和柠檬酸的应用。

44、作为优选，所述应用包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：

45、将所述待测样品、衍生试剂与酸化剂进行混合，得到混合溶液；

46、所述衍生试剂包括衍生试剂a、衍生试剂b和溶剂；所述衍生试剂a包括含有氨基的芳香化合物；所述衍生试剂b包括碳二亚胺类化合物；所述溶剂包括有机溶剂；

47、所述碳二亚胺类化合物的结构式为r-n＝c＝n-r’，r和r’相互独立、相同或不同地代表未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基、未被取代的c3～c7的环烷基、被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基；

48、所述胺基包括r1-nh2、r2-nhr3或r4-nr5r6，其中r1～r6代表相互独立、相同或不同地代表未取代的c1～c3的烷基。

49、当所述r和/或r’为被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～100vol％；

50、当所述r和r’为未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基或未被取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％。

51、优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙腈、异丙醇和二甲基甲酰胺中的一种或几种。

52、进一步优选地，所述衍生试剂a包括苯胺、邻苯二胺、苄胺、2-氨基萘和2,3-二氨基萘中的一种或几种；所述衍生试剂b中，所述碳二亚胺类化合物包括二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺中的一种或几种。

53、进一步优选，所述衍生试剂a包括邻苯二胺，所述衍生试剂b包括1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

54、第四方面，本发明提供一种液相色谱检测草酸和柠檬酸的方法，包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：

55、将所述待测样品、衍生试剂与酸化剂进行混合，得到混合溶液；

56、所述衍生试剂包括衍生试剂a、衍生试剂b和溶剂；所述衍生试剂a包括含有氨基的芳香化合物；所述衍生试剂b包括碳二亚胺类化合物；所述溶剂包括有机溶剂；

57、所述碳二亚胺类化合物的结构式为r-n＝c＝n-r’，r和r’相互独立、相同或不同地代表未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基、未被取代的c3～c7的环烷基、被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基；

58、所述胺基包括r1-nh2、r2-nhr3或r4-nr5r6，其中r1～r6代表相互独立、相同或不同地代表未取代的c1～c3的烷基。

59、当所述r和/或r’为被胺基取代的c1～c7的直链烷基、被胺基取代的c3～c7的支链烷基或被胺基取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～100vol％；

60、当所述r和r’为未被取代的c1～c7的直链烷基、未被取代的c3～c7的支链烷基或未被取代的c3～c7的环烷基时，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％。

61、优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙腈、异丙醇和二甲基甲酰胺中的一种或几种。

62、更优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜。

63、本发明发现，衍生试剂中引入碳二亚胺类化合物时，通过优化溶剂的选择能够显著提高检测的灵敏度，同时还能够显著降低衍生反应的温度，大幅提高衍生反应效率。

64、作为优选，所述衍生试剂a包括苯胺、邻苯二胺、苄胺、2-氨基萘和2,3-二氨基萘中的一种或几种。

65、优选地，所述衍生试剂b中碳二亚胺类化合物包括二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、二叔丁基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、1-叔丁基-3-环戊基碳二亚胺、二异己基碳二亚胺和1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种。

66、作为优选，所述衍生试剂b中，当碳二亚胺类化合物为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺时，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～100vol％；优选地，所述溶剂中有机溶剂的含量为40～50vol％；

67、当碳二亚胺类化合物为二叔丁基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-叔丁基-3-环戊基碳二亚胺、二异己基碳二亚胺和1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种时，所述溶剂中有机溶剂的含量为80～100vol％。

68、作为优选，所述衍生试剂b包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；和/或，所述衍生试剂a包括邻苯二胺。

69、优选地，所述含有氨基的芳香化合物和所述碳二亚胺类化合物的质量比为(100～300)：(100～300)；更优选为(180～220)：(200～300)。

70、作为优选，所述酸化剂选自盐酸、磷酸和硫酸中的一种或几种。

71、本发明中，所述酸化剂的浓度为6～12mol/l。

72、进一步优选地，所述酸化剂为盐酸。

73、作为优选，所述待测样品和所述衍生试剂的混合物与所述酸化剂的体积比为300：10～50。

74、作为优选，所述衍生处理的温度为20～60℃，时间为1～5min。

75、进一步优选地，所述衍生处理的温度为20～30℃，时间为1～2min。

76、本发明中，将待测样品进行所述衍生化处理后，能够在兼顾降低衍生化处理的温度和时间的同时保证衍生化效果。

77、在具体实施过程中，在进行所述衍生化处理前，本领域技术人员能够根据实际情况将待测样品进行除杂，优选地，将所述待测样品进行离心处理。

78、作为优选，所述的液相色谱检测草酸和柠檬酸的方法还包括：将所述第二混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测。

79、作为优选，所述液相色谱检测的条件包括：色谱柱包括c18柱或pfp柱；更优选地，所述pfp柱的规格为4.6×150mm，3μm。

80、本发明发现，在所述检测体系下，常规的c18柱或pfp柱均能实现草酸和柠檬酸的检测，但相较而言，所述的衍生体系更适用pfp柱，而常规的c18柱在检测时容易出现干扰物。

81、本发明中，对于流动相的选择可以选择已公开的检测草酸和柠檬酸时的现有技术中使用的流动相，如流动相a为体积分数为0.01vol～1vol％的甲酸水溶液；流动相b为甲醇或乙腈。

82、作为优选，为了更好地匹配所述的检测方法，所述液相色谱检测包括使用以下流动相a和流动相b进行梯度洗脱，其中，流动相a为0.1vol～0.5vol％甲酸水溶液；流动相b为甲醇或乙腈；

83、进一步优选地，所述梯度洗脱的洗脱条件为：

84、

85、其中，％代表体积百分比，且流动相a的体积百分比与流动相b的体积百分比和为1。

86、更进一步地，所述梯度洗脱的洗脱条件为：

87、

88、其中，％代表体积百分比。

89、作为优选，所述液相色谱检测的条件还包括：

90、柱温：38～42℃；

91、进样体积：25～35μl(具体可根据仪器灵敏度进行调整)；

92、样本管理器温度：10℃；

93、流速：0.8～1.2ml/min；

94、紫外检测器条件：

95、波长314nm

96、采样率10hz

97、时间常数2s

98、开始时间(min)  结束时间(min)  波长(nm)

99、  0.00          9.00           314

100、  9.00          19.00          254

101、第五方面，本发明进一步提供一种用于实施所述液相色谱检测草酸和柠檬酸的方法的试剂盒，包括待测样品、衍生试剂和酸化剂；所述待测样品包括检测样本、校准品和质控品中的至少一种；所述检测样本包括尿液或血液。

102、作为优选，所述校准品中草酸的浓度范围为10～250μg/ml；所述质控品中草酸的浓度范围为30～175μg/ml。

103、作为优选，所述校准品中柠檬酸的浓度范围为40～1000μg/ml；所述质控品中柠檬酸的浓度范围为120～700μg/ml。

104、基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：

105、本发明将碳二亚胺类化合物引入衍生试剂，同时通过优化衍生试剂的溶剂，能在保证衍生化效果的同时，不仅大大降低衍生化反应的温度，使衍生化的条件更温和，且大大降低了衍生化的时间，提高了衍生化的效率。此外，该检测方法能满足检测草酸、柠檬酸的线性、重复性、批间差、准确度等的要求，对评估尿液草酸、柠檬酸含量有重要参考意义。