一种高效去除甲基亚砷酸盐的谷氨酸棒状杆菌菌株构建方法

本发明涉及生物工程，具体涉及一种高效去除甲基亚砷酸盐的谷氨酸棒状杆菌菌株构建方法。

背景技术：

1、砷是一种剧毒的类金属元素，在自然环境中无机砷会转化成五价有机砷，三价有机砷，芳香族和甲基砷。五价有机砷相对温和，毒性低于无机砷；然而，芳香族和甲基砷在环境中降解为毒性更强的无机形式，会造成食物和水资源污染，严重威胁生物群和人类健康。与有机污染物不同的是金属和类金属元素不能被破坏，但它们可以被固定或转化为毒性较小的形式。

2、目前,常用的甲基亚砷酸盐污染修复技术主要有吸附法、混凝沉淀法、氧化法、离子交换法、膜分离法、植物法等。由于传统的物化处理方法存在着能耗高、产生二次污染的特点,微生物法去除甲基亚砷酸盐因其高效、环保且成本低等优势而具有较大的应用前景。

3、有鉴于此，非常有必要开发一种用于高效去除甲基亚砷酸盐的微生物，助力砷污染的修复。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新的砷污染土壤修复技术：通过对谷氨酸棒状杆菌14067进行基因工程改造，构建一种高效修复甲基亚砷酸盐[mas(ⅲ)]污染的土壤的菌株。本发明的目的在于提供一种新的修复砷污染的重组菌株。该菌株可应用范围广，可应用性强且高效，环保，成本低；通过构建出可固定甲基亚砷酸盐[mas(ⅲ)]的菌株对砷污染土壤进行修复。相较于目前已知的研究方法，本发明的方法简单，绿色环保，可应用范围广便于推广应用。

2、为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明提供一种高效去除甲基亚砷酸盐污染土壤的谷氨酸棒状杆菌菌株构建方法，其包括以下步骤：

4、步骤s1：根据ncbi数据库genbank:kf899847.1构建包含对甲基亚砷酸盐敏感的操纵子arsr和甲基亚砷酸盐的裂解基因arsi序列并扩增此序列；

5、步骤s2：优化过后的基因序列与pxmj19进行重组，构建cmas质粒；

6、步骤s3：将得到的质粒通过电转转化进入谷氨酸棒状杆菌构建而成。

7、步骤s1中，所述甲基亚砷酸盐敏感的操纵子arsr及甲基亚砷酸盐的裂解基因序列arsi如seq id no：1所示。

8、步骤s1中，所述扩增序列的pcr引物如下：

9、目的基因片段扩增引物

10、 引物名称 sequence(5’-3’) ars-f agcccttgccgataagataagg ars-r ctcggcttgcaactttttcga

11、阳性转化子验证引物

12、 引物名称 sequence(5’-3’) cmas-f aagtttaaagcccttgccga cmas-r aggttggtggatgtgtgctg

13、步骤s2中，所述构建cmas质粒，进一步包括如下步骤：

14、第一步：引物设计

15、其中表1目的基因片段扩增引物

16、 引物名称 sequence(5’-3’) ars-f agcccttgccgataagataagg ars-r ctcggcttgcaactttttcga

17、第二步：目的蛋白基因片段扩增

18、使用诺唯赞2×taq master mix(dye plus)(p111)进行pcr扩增目的基因片段。优选地，所述pcr扩增体系：

19、 模板dna 1ul 引物f/r 各2ul 2×taqmastermix 25ul 水 20ul 总体系 50ul

20、bio-rad pcr扩增程序：

21、

22、第三步：对pxmj19空质粒载体进行双酶切(hindⅲ和bamhⅰ)

23、优选地，所述酶切体系：

24、

25、优选地，所述酶切反应条件：37℃水浴酶切30min，1％琼脂糖凝胶验证质粒载体是否完全酶切，利用胶回收试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。

26、第四步：片段与质粒连接

27、将酶切质粒与目的基因片段混合，利用诺唯赞clonexpress multis one stepcloning kit(c113-01)无缝克隆试剂盒进行连接，并将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α(维地生物dl1001)中。

28、优选地，所述酶切质粒与目的基因片段体积比为1：3。

29、优选地，所述连接体系与反应条件：

30、

31、第五步：阳性转化子的菌落pcr验证

32、其中，所述阳性转化子的菌落pcr验证引物为目的基因扩增引物，pcr程序相同。

33、第六步：cmas重组质粒提取

34、将获得的阳性转化子接种到培养基中扩大培养，通过质粒提取试剂盒提取重组质粒cmas。

35、本发明还提供了一种上述方法构建的一种高效去除甲基亚砷酸盐的谷氨酸棒杆菌菌株。

36、本发明还提供了一种上述谷氨酸棒状杆菌在去除甲基亚砷酸盐中的应用。

37、本发明的有益效果：

38、本发明通过对谷氨酸棒状杆菌进行基因工程改造，构建出可去除甲基亚砷酸盐[mas(ⅲ)]的菌株，用于砷污染土壤的修复。相较于目前已知的方法，本发明的方法简单，去除砷的效果好，成本低，绿色环保，应用范围广。