基于李斯特菌的癌症治疗性疫苗的通用构建方法与流程

本发明涉及生物学，特别涉及一种基于李斯特菌的癌症治疗性疫苗的通用构建方法。

背景技术：

1、癌症是全球最主要的公共卫生问题，也是疾病负担最大的影响因素。目前癌症常见的治疗方案有手术摘除及放化疗联用，患者术后生活质量较差，给患者造成极大的心理损伤。

2、免疫治疗是一种通过主动或被动激活机制，促使机体生成针对肿瘤细胞的特定免疫反应，从而达到有效抑制乃至消灭肿瘤细胞的治疗方法。而肿瘤癌症治疗性疫苗是免疫疗法的一种，针对肿瘤相关抗原设计疫苗，具有靶向个体肿瘤突变特征的可行性、安全性和免疫治疗活性，是癌症免疫治疗的热门选择。活菌载体疫苗是以减毒活菌为载体的疫苗，以减毒活菌作为载体提呈抗原，不仅能使宿主获得对相关病原菌的免疫保护，还能额外获得对与插入的癌症抗原基因相对应的疾病的保护力。与其他疫苗种类相比，减毒活菌载体疫苗可以携带较长的多价癌症抗原基因以制备多价疫苗，具有更高更持久的免疫保护效果，同时因其作用位点明确、安全性较高，已逐渐成为基因工程疫苗的热点。

3、传统的李斯特菌载体疫苗的构建通常需引入携带相关疾病癌症抗原基因的质粒，通过质粒表达抗原蛋白，经李斯特菌递呈后激活自身免疫反应，以到达消除对应病原体的作用，为了筛选方便通常会在质粒上添加抗生素抗性基因，随着疫苗在体内存在时间的增长可能会造成质粒丢失、机体耐药性出现等不良影响。现有技术缺乏一种质量可靠且不良影响更小的李斯特菌载体疫苗。

4、因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于李斯特菌的癌症治疗性疫苗的通用构建方法，旨在解决背景技术中所提到的李斯特菌疫苗所存在的技术问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种基于李斯特菌的癌症治疗性疫苗的通用构建方法，包括：

4、用asd营养基因替换pcw-lmda l-amp回补质粒上的amp抗性基因，得到pcw-lmdal-ampfree回补质粒；

5、向pcw-lmda l-ampfree回补质粒中插入癌症抗原基因，得到pcw-癌症抗原基因-lmda l-ampfree回补质粒；

6、将pcw-癌症抗原基因-lmda l-ampfree回补质粒转入李斯特菌营养缺陷株中，获得癌症治疗性疫苗。

7、在本发明一种可选的实施方式中，所述用asd营养基因替换pcw-lmda l-amp回补质粒上的amp抗性基因，得到pcw-lmda l-ampfree回补质粒包括：

8、通过肉汤培养的方式对携带含asd基因的pya876质粒的大肠杆菌1、携带pcw-lmdal-amp回补质粒的大肠杆菌2和不含asd基因的大肠杆菌3进行菌株复苏；

9、通过离心吸附的方式从复苏后的大肠杆菌1中和大肠杆菌2中分别提取得到pya876质粒和pcw-lmda l-amp回补质粒；

10、对pcw-lmda l-amp回补质粒进行反向pcr扩增后胶回收，获得pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体；

11、对pya876质粒进行反向pcr扩增后胶回收，获得asd基因片段；

12、制备大肠杆菌3的感受态菌株；

13、通过无缝克隆体系连接pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体和asd基因片段后转入在大肠杆菌3的感受态菌株中转化，获得携带pcw-lmda l-ampfree回补质粒的大肠杆菌4。

14、在本发明一种可选的实施方式中，所述通过肉汤培养的方式对携带含asd基因的pya876质粒的大肠杆菌1、携带pcw-lmda l-amp回补质粒的大肠杆菌2和不含asd基因的大肠杆菌3进行菌株复苏包括：

15、取用甘油保存于冷冻温度下的携带含asd基因的质粒pya876的大肠杆菌1、携带pcw-lmda l-amp回补质粒的大肠杆菌2于la肉汤中，以及不含asd营养基因的大肠杆菌3于lb-dap肉汤中，在第一设定温度、第一设定转速下培养第一时间。

16、在本发明一种可选的实施方式中，所述通过离心吸附的方式从复苏后的大肠杆菌1中和大肠杆菌2中分别提取得到pya876质粒和pcw-lmda l-amp回补质粒包括：

17、取复苏后的大肠杆菌1中和大肠杆菌2于无菌离心管中过夜培养后去上清液；

18、往去上清液后的无菌离心管中加入buffer p1试剂震荡均匀后加入buffer p2试剂震荡均匀；

19、待无菌离心管内的溶液清亮粘稠后加入buffer p3试剂混匀并放置一段时间后，收集全部上清液转移至过滤柱中；

20、收集滤液转移到另一无菌离心管中加入异丙醇混匀，之后将得到的混合液分多次转移到吸附柱中离心处理后弃废液，再加入buffer pw试剂离心处理后弃废液并重复一次；

21、空离一定时间后将吸附柱转移至又一无菌离心管中并加入无菌水静置一段时间后再离心处理，检测浓度和纯度后得到pya876质粒和pcw-lmda l-amp回补质粒。

22、在本发明一种可选的实施方式中，所述对pcw-lmda l-amp回补质粒进行反向pcr扩增后胶回收，获得pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体包括：

23、将pcw-lmda l-amp回补质粒利用高保真酶2×phanta f l ash master mi x和引物asd-vector按照设定反应条件和体系进行反向pcr扩增；

24、将pcr产物于琼脂糖凝胶并以特定电压电泳一定时间；

25、将电泳结束后的凝胶在i br i ght凝胶成像系统的紫外光照射下一定时间内切下目的条带，将胶块转移至无菌ep管中；

26、往无菌ep管加入buffer xp试剂，金属浴加热至完全融化；

27、将融化后的凝胶溶液分多次全部转移至吸附柱中，离心处理后弃上清；再加入buffer xp2试剂，离心处理后弃废液；再加入spw wash buffer试剂后离心处理弃废液；

28、空离一定时间后开盖挥发一定时间，将吸附柱转移至又一无菌离心管中并加入无菌水静置一定时间再离心处理；检测浓度和纯度后得到pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体。

29、在本发明一种可选的实施方式中，所述制备大肠杆菌3的感受态菌株包括：

30、将复苏的大肠杆菌3接种于lb-dap肉汤中过夜培养；

31、按1:100比例将过夜培养的大肠杆菌3接种于lb-dap肉汤中培养至od600＝0.5；

32、对lb-dap肉汤进行冰浴处理后按分装至提前预冷的无菌离心管中，在一定转速条件下离心一定时间弃净上清；

33、再向无菌离心管中加入cac l2轻柔重悬管底全部沉淀，接着将无菌离心管进行冰浴处理，取出后立即离心处理并弃净上清；

34、再接着加入含甘油的cac l 2轻柔重悬，之后分装至盛装无菌离心管中于冷冻温度储存。

35、在本发明一种可选的实施方式中，所述向pcw-lmda l-ampfree回补质粒中插入癌症抗原基因，得到pcw-癌症抗原基因-lmda l-ampfree回补质粒包括：

36、通过肉汤培养的方式对携带癌症抗原基因质粒的大肠杆菌5进行菌株复苏；

37、通过离心吸附的方式分别从复苏后的大肠杆菌5中和大肠杆菌4中提取得到癌症抗原基因质粒和pcw-lmda l-ampfree回补质粒；

38、通过对pcw-lmda l-ampfree回补质粒进行酶切和胶回收，获得pcw-lmda l-ampfree线性载体；

39、通过对癌症抗原基因质粒进行反向pcr扩增和胶回收，获得抗原目的基因片段；

40、制备大肠杆菌3的感受态菌株；

41、通过无缝克隆体系连接pcw-lmda l-ampfree线性载体和抗原目的基因片段后转入在大肠杆菌3的感受态菌株中转化，获得携带pcw-癌症抗原基因-lmda l-ampfree回补质粒的大肠杆菌6。

42、在本发明一种可选的实施方式中，所述通过无缝克隆体系连接pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体和asd基因片段后转入在大肠杆菌3的感受态菌株中转化，获得携带pcw-lmda l-ampfree回补质粒的大肠杆菌4包括：

43、将pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体和asd基因片段按一定比例组合并配置得到无缝克隆体系；

44、反应后将pcw-lmda l-amp回补质粒线性载体和asd基因片段的连接组份通过无菌枪头加入大肠杆菌3的感受态菌株中进行转化；

45、将加入连接组份的大肠杆菌3的感受态菌株的转移至预热的lb肉汤中并离心处理；

46、再将离心处理后的lb肉汤涂到lb平板上培养，获得携带pcw-lmda l-ampfree回补质粒的大肠杆菌4。

47、在本发明一种可选的实施方式中，所述李斯特菌营养缺陷株包括单增李斯特菌营养缺陷株和绵羊李斯特菌营养缺陷株。

48、有益效果：本发明公开了一种基于李斯特菌的癌症治疗性疫苗的通用构建方法，其中，通用构建方法包括：用asd营养基因替换pcw-lmda l-amp回补质粒上的amp抗性基因，得到pcw-lmda l-ampfree回补质粒；向pcw-lmda l-ampfree回补质粒中插入癌症抗原基因，得到pcw-癌症抗原基因-lmda l-ampfree回补质粒；将pcw-癌症抗原基因-lmda l-ampfree回补质粒转入李斯特菌营养缺陷株中，获得癌症治疗性疫苗。本发明以李斯特菌平衡致死系统为载体进行了癌症治疗性疫苗的构建，获得的癌症治疗性疫苗具有更高的安全性、免疫原性及体内稳定性，能够起到更好的癌症治疗效果。