一种L19-DCN重组蛋白及其制备方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种l19-dcn重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、dcn是一种典型的富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，同时也是具有多种生物活性的细胞外基质(extracellular matrix,ecm)重要组分之一。dcn影响广泛的生物过程，包括细胞的生长、分化、增殖、粘附、扩散和迁移。同时已有研究证实dcn具有强大的抗炎、抑制细胞因子和抗纤维生成作用。dcn还能抑制促纤维化因子如转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β,tgf-β)，能够与多种因子或细胞膜受体相互作用，在纤维化的发生发展中发挥重要功能。

2、纤连蛋白(fibronectin,fn)是一种糖蛋白，其大小范围为230～270kda，通常以二聚体形式存在，通过c末端的一对二硫键共价连接，主要存在于细胞外基质和质膜中。fn调节广泛的细胞和发育功能，包括细胞粘附、迁移、生长、增殖和伤口愈合，同时结合多种细胞外基质蛋白，如整合素、胶原蛋白和纤维蛋白，是间充质细胞主要标志物之一。大量证据表明，许多肿瘤ecm蛋白与肿瘤进展和转移密切相关。edb结构域在小鼠、人类和其他哺乳动物中是相同的，积聚在攻击性肿瘤和经历血管生成的其他组织内的新生血管性结构。有研究表明，利用放射性碘标记的人重组单链抗体scfv(l19)靶向fn的edb结构域，在体内证明了靶向新形成的肿瘤血管的可能性，从而为选择性地将治疗药物输送到新生血管奠定了基础，(l19)是一种高亲和力的人类抗体片段scfv，其特异地结合纤维连接蛋白edb结构域。

3、肺纤维化(pulmonary fibrosis,pf)是一种毁灭性的、不可逆的、致命的慢性肺部疾病，主要特征包括瘢痕形成、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,emt)失衡、免疫细胞异常募集、成纤维细胞的异常增殖和转化、ecm的过度分泌和沉积、随后肺结构的不可逆破坏和纤维化。pf的病因和确切发病机制尚未阐明，因此也被成为特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,ipf)。虽然新的抗纤维化药物如吡非尼酮和尼达尼布有一定的治疗作用，但ipf的发病率和死亡率几乎没有改善。因此，迫切需要探索ipf的发病机制，寻找新的治疗方法。tgf-β、血小板衍生生长因子和结缔组织生长因子等纤维化因子的刺激下，肺病变中的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，并伴有高分泌表型，由此产生大量的纤维状细胞外基质蛋白，如胶原和纤维粘连蛋白。因此，将人单链抗体片段scfv(l19)与dcn融合到一起得到一种全新结构的重组蛋白具有现实意义。

4、随着生物技术的迅速发展，真核表达系统作为一种重要的工具在生物医药领域的研究和应用中扮演着关键的角色。真核表达系统允许研究人员在真核细胞中表达外源性基因，从而产生特定的蛋白质。与原核表达系统相比，真核表达系统能够实现对复杂蛋白质的正确折叠、修饰和定位，因此在生产重组蛋白、研究蛋白功能活性等方面，使用真核表达系统生产l19-dcn重组蛋白是最优选择。

技术实现思路

1、针对现阶段应用常规药物治疗纤维化，本发明提供了一种真核细胞表达系统生产可溶的l19-dcn重组蛋白及其在治疗纤维化药物中的应用。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种l19-dcn重组蛋白，包含：dcn成熟肽氨基酸序列，连接到所述dcn成熟肽氨基酸序列n端的l19成熟肽氨基酸序列，连接到l19成熟肽氨基酸序列n端的igh信号肽段，以及连接到dcn成熟肽氨基酸序列c端的标签肽段；所述标签肽段为组氨酸标签序列；所述l19成熟肽氨基酸序列通过亲水性linker序列连接到dcn成熟肽氨基酸序列n端。

4、优选的，上述的一种l19-dcn重组蛋白，所述l19-dcn重组蛋白的氨基酸序列如seqid no:5所示。

5、优选的，上述的一种l19-dcn重组蛋白，所述dcn成熟肽氨基酸序列如seq id no:1所示。

6、优选的，上述的一种l19-dcn重组蛋白，所述l19成熟肽氨基酸序列为人源单链抗体片段scfv，l19成熟肽氨基酸序列如seq id no:2所示。

7、优选的，上述的一种l19-dcn重组蛋白，所述组氨酸标签序列为六聚组氨酸his 6。

8、优选的，上述的一种l19-dcn重组蛋白，所述igh信号肽氨基酸序列如seq id no:3所示。

9、优选的，上述的一种l19-dcn重组蛋白，所述亲水性linker序列的氨基酸序列如seq id no:4所示。

10、上述任意一项所述的l19-dcn重组蛋白的编码基因，包含：编码dcn成熟肽氨基酸基因序列，连接到dcn成熟肽氨基酸基因序列5’端的l19成熟肽氨基酸基因序列，连接到l19成熟肽氨基酸基因序列5’端的igh信号肽段的编码基因序列，以及连接到dcn成熟肽氨基酸基因序列3’端的标签肽段的编码基因序列；所述标签肽段的编码基因序列为组氨酸标签编码基因序列；所述编码dcn成熟肽氨基酸基因的核苷酸序列如seq id no:6所示；所述l19-dcn重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。

11、上述的一种l19-dcn重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

12、a.将igh-l19-linker编码基因连到骨架质粒上构建得到igh-l19-linker-pcdna3.1(+)重组质粒；

13、b.使用snapgene 9.0软件设计dcn基因上下游引物，在下游引物5’端加入组氨酸标签编码基因序列，pcr扩增出c端带有组氨酸标签的dcn成熟肽氨基酸编码基因，然后连到igh-l19-linker-pcdna3.1(+)重组质粒上构建得到l19-dcn重组蛋白的表达载体；

14、c.将l19-dcn重组蛋白的表达载体转染到hek293t细胞中，表达l19-dcn重组蛋白；

15、d.基于l19-dcn重组蛋白中的组氨酸标签亲和层析纯化得到l19-dcn重组蛋白。

16、上述任意一项所述的l19-dcn重组蛋白在抗纤维化活性药物中的应用。

17、上述任意一项所述的l19-dcn重组蛋白在抗肺纤维化活性药物中的应用。

18、本发明的有益效果为：

19、本发明以核心蛋白聚糖(dcn)原始结构为基础，首次设计了一种全新结构的l19-dcn重组蛋白，并首次构建了该重组蛋白的真核表达载体，随后将该重组真核表达载体转染hek293t细胞，能大量表达获取可溶性的重组蛋白。通过蛋白质标签亲和层析纯化后，可得到纯度较高的l19-dcn重组蛋白。所述方法能够得到氨基酸序列与l19-dcn成熟肽氨基酸序列一致的l19-dcn重组蛋白，该重组蛋白在纤维化、尤其是肺纤维化治疗方面有着良好的生物活性。

技术特征：

1.一种l19-dcn重组蛋白，其特征在于，包含：dcn成熟肽氨基酸序列，连接到所述dcn成熟肽氨基酸序列n端的l19成熟肽氨基酸序列，连接到l19成熟肽氨基酸序列n端的igh信号肽段，以及连接到dcn成熟肽氨基酸序列c端的标签肽段；所述标签肽段为组氨酸标签序列；所述l19成熟肽氨基酸序列通过亲水性linker序列连接到dcn成熟肽氨基酸序列n端；所述l19-dcn重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。

2.根据权利要求1所述的一种l19-dcn重组蛋白，其特征在于，所述dcn成熟肽氨基酸序列如seq id no:1所示。

3.根据权利要求1所述的一种l19-dcn重组蛋白，其特征在于，所述l19成熟肽氨基酸序列为人源单链抗体片段scfv，l19成熟肽氨基酸序列如seq id no:2所示。

4.根据权利要求1所述的一种l19-dcn重组蛋白，其特征在于，所述组氨酸标签序列为六聚组氨酸his 6。

5.根据权利要求1所述的一种l19-dcn重组蛋白，其特征在于，所述igh信号肽氨基酸序列如seq id no:3所示。

6.根据权利要求1所述的一种l19-dcn重组蛋白，其特征在于，所述亲水性linker序列的氨基酸序列如seq id no:4所示。

7.权利要求1-6中任意一项所述的l19-dcn重组蛋白的编码基因，其特征在于，包含：编码dcn成熟肽氨基酸基因序列，连接到dcn成熟肽氨基酸基因序列5’端的l19成熟肽氨基酸基因序列，连接到l19成熟肽氨基酸基因序列5’端的igh信号肽段的编码基因序列，以及连接到dcn成熟肽氨基酸基因序列3’端的标签肽段的编码基因序列；所述标签肽段的编码基因序列为组氨酸标签编码基因序列；所述编码dcn成熟肽氨基酸基因的核苷酸序列如seqid no:6所示；所述l19-dcn重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。

8.权利要求1所述的一种l19-dcn重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

9.权利要求1-6中任意一项所述的l19-dcn重组蛋白在抗纤维化活性药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述l19-dcn重组蛋白在抗肺纤维化活性药物中的应用。

技术总结本发明提供了一种基于核心蛋白聚糖(Decorin,DCN)结构为基础进行改造所得到的L19‑DCN重组蛋白，包含：DCN成熟肽氨基酸序列，通过亲水性Linker序列连接到DCN成熟肽氨基酸序列N端的L19成熟肽氨基酸序列，连接到L19成熟肽氨基酸序列N端的IgH信号肽氨基酸序列，以及连接到DCN成熟肽氨基酸序列C端的标签肽段，所述标签肽段为组氨酸标签序列。本发明还提供了编码该重组蛋白的基因、表达该重组蛋白的载体和重组工程细胞。本发明还进一步提供了L19‑DCN重组蛋白的制备方法，以及该重组蛋白在制备抗纤维化、尤其是抗肺纤维化活性药物中的探究。本发明的L19‑DCN重组蛋白可通过在真核细胞中大量并纯化，并且在纤维化治疗方面有着良好的生物活性。技术研发人员：毕秀丽,张鑫,符合受保护的技术使用者：辽宁大学技术研发日：技术公布日：2024/10/17