一种预测TBM神经功能愈后的生物标识-NLR的试剂盒及其应用

本专利涉及结核性脑炎神经功能预后的生物标识领域，具体而言，涉及一种能够预测结核性脑炎神经功能预后的生物标识-中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,tbm)主要是由原发感染肺部的结核分枝杆菌经血液循环或直接途径侵入蛛网膜下间隙引起脑膜隐匿性感染的中枢神经系统结核病。目前认为其发病机制是脑膜隐匿病灶(rich fcous)破裂释放炎症内容物，进入蛛网膜下腔和脑脊液循环，并刺激脑膜、累及脑神经、脑实质和脑血管等导致产生临床症状[1]。由于中枢神经系统存在血脑屏障及血脑脊液屏障，既往研究认为大脑是一个相对免疫豁免的器官[2-3]。但近年来的研究表明，大脑同样可发生炎症免疫反应,并且在病理条件下,外周免疫细胞也可进入中枢神经系统以增强大脑的免疫反应。神经元细胞死亡后通过释放“危险信号”，激活大脑固有免疫反应，促进炎性细胞因子、趋化因子、活性氧和一氧化氮等神经毒性物质产生导致血脑屏障破坏，并诱导外周免疫细胞进入神经系统产生免疫反应[4-5]。为抑制炎症免疫反应，各个国家的指南均推荐在结核性脑膜炎中使用糖皮质激素辅助治疗[6-7]。循证医学研究表明，糖皮质激素治疗可减少结核性脑膜炎约25％死亡，不改善神经功能残疾。最近一项在结核性脑膜炎合并hiv感染患者的临床试验推翻了糖皮质激素治疗在这类人群中的治疗作用,该研究结果发现地塞米松治疗对结核性脑膜炎合并hiv者在生存或任何次要终点方面无明显获益[8]。该研究认为糖皮质激素治疗效果可能在亚组中有所不同，但目前从抗炎治疗中受益的人群仍待进一步探索[8]。一项基于针对covid-19患者的回顾性队列发现，入院时系统性炎症指标中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil tolymphocyte ratio,nlr)可区分更高死亡风险的患者。在高危个体中使用糖皮质激素治疗降低随访60天全因死亡风险，但在低危死亡风险人群中使用糖皮质激素无明显治疗获益[9]。在另一项对急性呼吸窘迫综合征患者的研究中发现,较高的系统性炎症水平有助于识别对糖皮质激素治疗反应较好的个体，系统性炎症指数nlr可作为预测糖皮质激素治疗反应的新标志物[10]。

2、我们首先构建了一个1203名结核性脑炎患者的队列。病人除了包括实验室检查，以及发病前药物使用情况外，还进行了精神功能损伤评分[11-13]。广义混合效应模型分析提示较高的中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio,nlr≥4.88)与神经功能恶化(or＝1.65,95％ci 1.05-2.72,p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88,95％ci 1.117-3.01,p＝0.009)独立相关。为了进一步验证结果的准确性，又进行了系统性炎症水平(nlr≥4.88)和治疗结局相关性的敏感性分析，发现模型1结果提示,nlr≥4.88与早期神经功能恶化(or＝1.65；95％ci,1.05-2.72；p＝0.032)，随访神经功能残疾(or＝1.88；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)和死亡(hr＝2.64；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)相关。广义线性模型2(校正)结果提示,nlr≥4.88是早期神经功能恶化(or＝1.53；95％ci,1.17-3.01；p＝0.042)，随访神经功能残疾(or＝1.85；95％ci,1.36-2.52；p<0.001)独立危险因素。广义线性模型3(校正)结果发现,nlr≥4.88显著增加早期神经功能恶化(or＝1.65；95％ci,1.05-2.72；p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)风险。倾向性评分匹配后，地塞米松治疗不改善神经功能恶化结局(or＝1.12,95％ci 0.74-1.69,p＝0.598)和降低随访残疾率(or＝1.05,95％ci 0.78-1.42,p＝0.757)。地塞米松治疗在nlr风险分层和其他亚组中未显示出获益。由此可见系统性炎症水平(nlr≥4.88)增加tbm患者早期神经功能恶化和随访神经功能残疾风险。地塞米松治疗不改善神经功能结局，其治疗效果在不同系统性炎症水平分层和其他亚组中未显示出获益。

3、有鉴于此，特提出一种能够预测结核性脑炎神经功能预后的生物标识-中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的专利申请。

4、参考文献

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技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种能够预测结核性脑炎神经功能预后的生物标识-中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的试剂或组件，提高结核性脑炎的精准诊断和治疗能力。

2、本发明的第二目的在于提供上述试剂盒在nlr≥4.88能够预测结核性脑炎患者早期神经功能恶化(or＝1.65,95％ci 1.05-2.72,p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88,95％ci 1.117-3.01,p＝0.009)。神经功能预后依据：1)神经功能评分，包括英国医学研究学会分期、glasgow昏迷量表(glasgow coma score,gcs)和是否存在局灶性神经系统体征为标准；2)神经功能预后评分，扩展残疾严重程度评分(expanded disability statusscore,edss)。

3、本发明的第三目的在于提供一种上述试剂盒在制备用于预测结核性脑炎神经功能预后的诊断产品中的应用。

4、本发明的第四目的在于提供一种上述用于预测结核性脑炎神经功能预后的智能产品中的应用。

5、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

6、本发明提供一套能够预测结核性脑炎神经功能预后的生物标识-中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括用于检测中性粒细胞-淋巴细胞的试剂和/或组件，所述比值为nlr≥4.88。nlr≥4.88与早期神经功能恶化(or＝1.65,95％ci 1.05-2.72,p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88,95％ci 1.117-3.01,p＝0.009)独立相关。据此nlr≥4.88可作为预测结核性脑炎神经功能预后的生物标识。

7、在一些实施方式中，本发明构建了一个1203名结核性脑炎患者的队列。分别进行了1)神经功能评分：使用英国医学研究学会分期、glasgow昏迷量表(glasgow coma score,gcs)和是否存在局灶性神经系统体征为标准,将临床严重程度分为3期：i期，意识清晰，无神经系统定位体征；ii期，gcs评分10-14分伴或不伴神经系统定位体征,或gcs评分为15分伴神经系统定位体征；iii期，gcs评分＜10分，伴或不伴神经系统定位体征。2)神经功能预后评分：使用扩展残疾严重程度评分(expanded disability status score,edss)来测量基线和治疗后7天的神经功能缺损。edss评分范围包括:0分(无残疾)到10分(死亡)[14-15]。上述为预测结核性脑炎造成的神经功能损伤提供了客观依据。

8、在一些实施方式中，本发明又进行了系统性炎症水平(nlr≥4.88)和治疗结局相关性的敏感性分析：

9、广义线性模型1结果提示,nlr≥4.88与早期神经功能恶化(or＝1.65；95％ci,1.05-2.72；p＝0.032),随访神经功能残疾(or＝1.88；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)和死亡(hr＝2.64；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)相关。

10、广义线性模型2(校正)结果提示,nlr≥4.88是早期神经功能恶化(or＝1.53；95％ci,1.17-3.01；p＝0.042),随访神经功能残疾(or＝1.85；95％ci,1.36-2.52；p<0.001)独立危险因素。

11、广义线性模型3(校正)结果发现,nlr≥4.88显著增加早期神经功能恶化(or＝1.65；95％ci,1.05-2.72；p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)风险。从而再次证实nlr≥4.88可作为预测结核性脑炎早期神经功能恶化和随访神经功能残疾的生物标识。

12、在一些实施方式中，本发明倾向性评分匹配后，地塞米松治疗不改善神经功能恶化结局(or＝1.12,95％ci 0.74-1.69,p＝0.598)和降低随访残疾率(or＝1.05,95％ci0.78-1.42，p＝0.757)。地塞米松治疗在nlr风险分层和其他亚组中未显示出获益。nlr不能作为预测地塞米松治疗结核性脑炎疗效的生物标识。

13、在一些实施方式中，上述用于所述用于检测中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的试剂和/或组件包括显微镜分类计数、流式细胞术、转录组芯片和单细胞测序的一种或几种。

14、在一些实施方式中，上述用于预测结核性脑炎神经功能预后的分析和/或组件包括智能aap、智能软件的一种或几种。

15、在一些实施方式中，上述试剂盒在制备用于预测结核性脑炎神经功能预后的诊断产品中应用。

16、在一些实施方式中，上述试剂盒对中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)进行检测。

17、在一些实施方式中，上述检测中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的方法包括以下一种或几种：显微镜分类计数、双鞘流技术，电阻抗法，无氰比色法，流式细胞术、转录组芯片和单细胞测序。

18、在一些实施方式中，上述检测中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)的显微镜分类计数方法包括：普通显微镜法和荧光显微镜法的一种或几种。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

20、1)、本发明试剂盒、应用和方法中所涉及的中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)，nlr≥4.88能够作为结核性脑炎患者早期神经功能恶化(or＝1.65,95％ci 1.05-2.72,p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88,95％ci1.117-3.01,p＝0.009)预测的生物标识。本发明试剂盒涉及一个1203名结核性脑炎患者的队列，并对每位患者进行了神经功能评分和神经功能预后评分，从而获得客观的预测结核性脑炎造成的神经功能损伤指标。为了进一步明确系统性炎症水平(nlr≥4.88)能否预测结核性脑炎神经功能预后，又进行了敏感性分析。广义线性模型1结果提示,nlr≥4.88与早期神经功能恶化(or＝1.65；95％ci,1.05-2.72；p＝0.032),随访神经功能残疾(or＝1.88；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)和死亡(hr＝2.64；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)相关。广义线性模型2(校正)结果提示,nlr≥4.88是早期神经功能恶化(or＝1.53；95％ci,1.17-3.01；p＝0.042),随访神经功能残疾(or＝1.85；95％ci,1.36-2.52；p<0.001)独立危险因素。广义线性模型3(校正)结果发现,nlr≥4.88显著增加早期神经功能恶化(or＝1.65；95％ci,1.05-2.72；p＝0.032)和随访神经功能残疾(or＝1.88；95％ci,1.17-3.01；p＝0.009)风险。从而再次证实nlr≥4.88可作为预测结核性脑炎早期神经功能恶化和随访神经功能残疾的生物标识。因此通过检测外周血中性粒细胞-淋巴细胞比值预测结核性脑炎的神经功能预后。

21、2)、本发明试剂盒、应用和方法中所涉及的中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio nlr)，倾向性评分匹配后，地塞米松治疗不改善神经功能恶化结局(or＝1.12,95％ci 0.74-1.69,p＝0.598)和降低随访残疾率(or＝1.05,95％ci0.78-1.42,p＝0.757)。地塞米松治疗在nlr风险分层和其他亚组中未显示出获益。nlr不能作为预测地塞米松治疗结核性脑炎疗效的生物标识。提示nlr≥4.88可作为预测结核性脑炎早期神经功能恶化和随访神经功能残疾的生物标识特异性强。