一种与花生蛋白含量相关的分子标记及相关应用的制作方法

本发明属于基因工程，尤其涉及一种与花生蛋白含量相关的分子标记及相关应用。

背景技术：

1、花生作为世界重要的油料作物和经济作物，对保障粮油安全、食品安全具有重要的作用。花生蛋白的营养价值与动物新蛋白差异不大，营养价值可与肉类、牛奶、鸡蛋等相仿，比粮食作物要高；花生蛋白中氨基酸分布广泛，含有人体必需氨基酸8种，另外，还富含精氨酸、谷氨酸和天门氨酸，有利于调节血糖，保护肝脏，并对脑细胞发育和增强记忆有良好的作用。并且花生蛋白含量均超过其他坚果(花生在24～27％，腰果15％，核桃15％)。花生食用的方式主要用来烘烤、油炸、水煮，或作为原料制成花生糖点、蛋白粉、生产花生饮料等，被称为“植物肉”，也是航天中的重要食品，随着人们生活水平的不断提高，食用花生比例逐渐增加，因而加强食用花生，特别是高蛋白花生研究具有重要意义。

2、目前有关花生蛋白遗传研究中，现有技术对花生蛋白群体分析得出，花生蛋白含量的遗传以加性基因效应为主；还有研究认为影响花生品质的基因效应加性和非加性均较为重要，得出蛋白含量受环境显著影响；相关技术人员依据影响花生蛋白的9个生态因子构建了花生蛋白含量的空间预测模型，结果表明，在北半球花生中蛋白的含量从高纬度地区到低纬度地区呈现增高趋势，也同样证明花生蛋白含量受环境等因素影响较大；另有研究表明通过群体进行分析得出，蛋白基因没有主基因效应，受到微效多基因控制，不同品种与不同环境间的互作影响存在差异，并且花生不同成熟度对蛋白影响较大。现有技术人员利用genefishing技术对诱变处理的花育22号种子，经rt-pcr验证，获得3个与蛋白合成相关的基因。并进一步对花生蛋白突变体籽粒不同发育时期转录组分析，分别获得2936个、3329个、2849个差异表达基因，并在其中筛选到15个与蛋白质合成相关的候选基因。但目前控制花生蛋白含量的主效基因仍未被发掘，相关调控机制研究相对滞后。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明为培育高蛋白花生新品种提供了高效率的选择工具，本发明提供的与花生蛋白含量相关的分子标记，能够有效提高判断花生蛋白含量的效率，提高花生育种效率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种与花生蛋白含量相关的分子标记chro1-kh，所述分子标记chro1-kh的正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示：actttcttttcataggcccagctc，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示：actagtggagccatattgacggtg。

4、在本发明中，所述分子标记位于花生1号染色体的95485614bp～95490150bp处。本发明对发生变异的序列进行分析，发现基因在其互补链上，基因序列上该位置低蛋白组为a，高蛋白组为t。kh domain-containing protein基因编码的蛋白，高蛋白花生在基因编码的蛋白质第410位氨基酸发生突变为异亮氨酸，而低蛋白花生在该基因编码的蛋白质第410位氨基酸为赖氨酸。

5、本发明还提供了一种检测花生蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的分子标记chro1-kh的正向引物和反向引物。

6、本发明还提供了上述的分子标记chro1-kh和/或上述的试剂盒在花生蛋白含量中的应用。

7、本发明还提供了一种花生蛋白含量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

8、1)以提取得到的被测花生的dna为模板，通过权利要求1所述的分子标记chro1-kh的引物进行pcr扩增，得到pcr产物；

9、2)当步骤1)扩增得到的pcr产物经克隆后，1类kh rna结合域cds序列的第1229位碱基位点处为t时，则被测花生属于高蛋白花生；

10、当步骤1)扩增得到的pcr产物经克隆后，1类kh rna结合域cds序列的第1229位碱基位点处为a时，则被测花生属于低蛋白花生。

11、在本发明中，所述步骤pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，14个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸2.5min。在本发明中，所述pcr扩增的体系包括：每25μl由10μm正向引物1.0μl、10μm反向引物1.0μl、0.5～1.0ng/μl花生dna 1.0μl、2×taq master masstermix 12.5μl和ddh2o 9.5μl组成。

12、本发明还提供了上述的分子标记chro1-kh和/或上述的试剂盒在培育高蛋白花生育种中的应用。

技术特征：

1.一种与花生蛋白含量相关的分子标记chro1-kh，其特征在于，所述分子标记chro1-kh的正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记chro1-kh，其特征在于，所述分子标记位于花生1号染色体的95485614bp～95490150bp处。

3.一种检测花生蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的分子标记chro1-kh的正向引物和反向引物。

4.权利要求1所述的分子标记chro1-kh和/或权利要求2所述试剂盒在花生蛋白含量中的应用。

5.一种花生蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，14个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸2.5min。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述pcr扩增的体系包括：每25μl由10μm正向引物1.0μl、10μm反向引物1.0μl、0.5～1.0ng/μl花生dna 1.0μl、2×taq mastermasstermix 12.5μl和ddh2o 9.5μl组成。

8.权利要求1所述的分子标记chro1-kh和/或权利要求2所述的试剂盒在培育高蛋白花生育种中的应用。

技术总结本发明公开了一种与花生蛋白含量相关的分子标记及相关应用。所述的分子标记位于花生1号染色体95485614bp～95490150bp，为RNA结合蛋白KH domain‑containing protein基因，在95487145bp处检测到一个SNP位点(T/A)，即该基因在其互补链上，基因序列上该位置(CDS序列第1229位碱基)低蛋白花生组为A、高蛋白花生组为T，导致赖氨酸到异亮氨酸(蛋白质第410位氨基酸)的突变。本发明首次在花生高蛋白资源分子标记辅助选择上提供了一个新标记，对于高蛋白花生资源筛选及高蛋白花生新品种选育均具有十分重要的意义。技术研发人员：于树涛,王传堂,于国庆,殷业超,张宇,董敬超,王力夫,张诗行,高磊磊,周文雨,王腾蛟,姜春娇受保护的技术使用者：辽宁省沙地治理与利用研究所技术研发日：技术公布日：2024/10/17