一种多肽组合、鉴定苹果过敏原蛋白Mald2的方法和应用与流程

本发明属于食品安全检测，具体涉及一种多肽组合、鉴定苹果过敏原蛋白mal d2的方法和应用。

背景技术：

1、近年来，随着人们健康意识的提高，食物过敏逐渐受到人们的关注。水果是引起过敏的食品之一。苹果过敏原蛋白主要分为4类蛋白家族：mal d1一种与桦树花粉中的主要抗原bet v1具有同源序列的过敏原；mal d2全称为索马甜蛋白样蛋白，是苹果中一种重要过敏原，与ige介导的症状相关联；mal d3属于脂质转移蛋白(ltps)家族；mal d4为profilin蛋白，同样是苹果中一种过敏原，与花粉过敏有关。

2、目前，常见的检测方法基于抗体抗原特异性结合的免疫学原理和核酸检测的方法。例如，基于免疫结合原理的酶联免疫吸附法(lisa)、western-blot免疫印迹杂交法和免疫层析技术。基于核酸检测的方法为实时定量荧光pcr(qpcr)、环介导等温扩增技术(lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等。

3、质谱鉴定技术在过敏原分析中受到重视。它主要通过检测过敏原蛋白消化产物的特异性肽，从而获得蛋白质成分、结构和序列信息。该质谱方法对过敏原蛋白的活性无要求，可同时检测变性与非变性的过敏原。近些年，质谱法在水果过敏原鉴定中逐渐出现。现有技术中未见利用肽段鉴定苹果过敏原蛋白的的报道，筛选特征肽段实现苹果过敏原蛋白的准确检测是急需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的提供一种多肽组合、鉴定苹果过敏原蛋白mal d2的方法和应用，提供的多肽组合作为生物标志物可以鉴定苹果过敏原蛋白mal d2。

2、为了解决上述的技术问题，提出了以下技术方案：

3、本发明提供了一种鉴定苹果过敏原蛋白mal d2的多肽组合，所述多肽组合包括第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明提供了上述技术方案所述的多肽组合作为生物标志物在制备鉴定苹果过敏原蛋白mal d2的产品中的应用。

5、本发明提供了上述技术方案所述的多肽组合作为生物标志物在制备区分苹果过敏原蛋白mal d2和其他苹果过敏原蛋白的产品中的应用。

6、优选的，所述其他苹果过敏原蛋白包括mal d1、mal d3和mal d4中的一种或几种。

7、本发明提供了一种鉴定苹果过敏原蛋白mal d2的方法，包括以下步骤：

8、对待检测样品进行蛋白提取，得到待检测样品蛋白；

9、将所述待检测样品蛋白和蛋白酶混合，进行酶解，得到酶解产物；

10、对所述酶解产物进行液相色谱-质谱联用检测，得到酶解产物的质谱信息；

11、当酶解产物的质谱信息能同时检出504.2/507.3、504.2/394.2、506.3/260.1和506.3/357.2四个离子对，且保留时间均为3.0～5.0min，表明酶解产物中含有第一多肽和第二多肽，则判定待检测样品中含有苹果过敏原蛋白mal d2。

12、优选的，所述液相色谱-质谱联用检测的液相单元检测的参数为：流动相a为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为乙腈；

13、液相单元检测的洗脱梯度如下：在第0～1min，流动相b的体积占比为5％，流动相a的体积占比为95％；在第1～10min，流动相b的体积占比为99％，流动相a的体积占比为1％；在第10～13min，流动相b的体积占比为99％，流动相a的体积占比为1％；在第13～13.1min，流动相b的体积占比为5％，流动相a的体积占比为95％；在第13.1～15min，流动相b的体积占比为5％，流动相a的体积占比为95％；流速为0.30ml/min；

14、所述液相色谱应用的色谱柱包括watersacquity beh c18色谱柱，规格：2.1×100mm，1.7μm。

15、优选的，所述液相色谱-质谱联用检测的质谱单元检测的参数为：

16、采用多反应监测模式进行正离子检测；

17、接口电压4.0kv，接口温度：300℃；雾化气流量：3.0l/min；干燥气流量：10l/min；加热气流量：10l/min；加热块温度：400℃；脱溶剂管温度：250℃；脱溶剂温度520℃；碰撞气为高纯氩气。

18、优选的，所述多反应监测模式下检测的第一多肽的离子对504.2/507.3的第一个四级杆偏差相关电压为-26v，第三个四级杆偏差相关电压为-40v，碰撞能量为-22ev；

19、所述mrm模式下检测的第一多肽的离子对504.2/394.2的第一个四级杆偏差相关电压为-36v，第三个四级杆偏差相关电压为-24v，碰撞能量为-27ev；

20、所述mrm模式下检测的第二多肽的离子对506.3/260.1的第一个四级杆偏差相关电压为-28v，第三个四级杆偏差相关电压为-26v，碰撞能量为-27.1ev；

21、所述mrm模式下检测的第二多肽的离子对506.3/357.2的第一个四级杆偏差相关电压为-20v，第三个四级杆偏差相关电压为-26v，碰撞能量为-27.1ev。

22、优选的，当所述待检测样品的形态为半固态或固态时，所述蛋白提取的方法包括：

23、将待检测样品与tris缓冲液进行第一混合，得到第一混合物；对所述第一混合物进行第一固液分离，收集液体组分，得到第一上清液；将所述第一上清液与丙酮进行第二混合，得到第二混合物，对所述第二混合物进行第二固液分离，收集固体组分，得到待检测样品蛋白；

24、当所述待检测样品的形态为液态时，所述蛋白提取的方法优选包括：

25、将待检测样品与丙酮第三混合，得到第三混合物；对所述第三混合物进行固液分离，收集固体组分，得到待检测样品蛋白。

26、优选的，所述酶解的方法包括：

27、利用碳酸氢铵溶液复溶所述待检测样品蛋白，得到复溶溶液；

28、在所述复溶溶液中依次加入碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液、碘代乙酰铵溶液、蛋白酶溶液，进行酶解，得到酶解产物。

29、本发明的技术效果：本发明提供了一种鉴定苹果过敏原的肽段，其特征在于，所述肽段包括第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。

30、本发明提供的第一多肽和第二多肽为苹果过敏原蛋白mal d2的特征肽段，具有质谱响应强度高、稳定性强的特点。在液相色谱-质谱联用检测的mrm通道中，第一多肽的离子对为504.2/507.3和504.2/394.2，断裂位点(b-y断裂)分别为y4和y3，电荷数均为2，具有较高的质谱响应。第二多肽的离子对为506.3/260.1和506.3/357.2，断裂位点为b2和b3，电荷数均为2，具有较高的质谱响应。

31、实施例结果表明，基于本发明提供的肽段能够正确判定出待测样本中是否含有苹果过敏原蛋白mal d2，以苹果含量计算，浓缩饮料中最低检出浓度为6.1g/100ml，果酱中最低检出浓度为3.2g/100g。