一种ttc21b基因突变位点及其应用

本申请涉及生物，尤其涉及一种ttc21b基因突变位点及其应用。

背景技术：

1、肾单位肾痨(nphp)是一种常染色体隐性遗传的肾小管间质性疾病，是引起儿童终末期肾脏病最常见的遗传性疾病之一。肾单位肾痨的临床症状包括多尿、多饮、继发性遗尿、贫血和生长发育迟缓，除了肾脏表型，该疾病还可能涉及多种肾外器官，包括肝脏、胰腺、眼睛和骨骼等。

2、nphp12的致病基因为ttc21b，该基因属于ttc21家族，位于2q24.3号染色体上，具有5415个碱基对，共包含29个外显子，编码具有1316个氨基酸的鞭毛内转运蛋白139(ift139)；而ift139是ift-a复合物的组成蛋白之一，主要参与纤毛顶端到基底部的逆向物质运输。ift139蛋白含有19个tpr结构域，该结构域由34个氨基酸构成，且一般是多个tpr序列串连排列所形成，该结构域会产生一个右手超螺旋结构，而该超螺旋结构与多蛋白复合体相关。

3、ttc21b基因敲除的小鼠是胚胎致死的，不适合做肾脏相关研究，并且斑马鱼是一种常用的研究纤毛病的模式生物。因此目前斑马鱼中有利用morpholino介导的ttc21b基因敲低动物模型，来研究ttc21b不同点突变的修饰基因情况，虽然为研究ttc21b不同点突变的致病性提供了一种可用模型，但是morpholino只能短期降低生物体内基因的表达，无法研究目的基因功能丧失的长期影响，因此如何提供一种ttc21b基因缺失靶位点，以实现对靶位点的准确敲除并长期降低生物体内基因的表达，是目前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本申请提供了一种ttc21b基因缺失位点及其应用，以解决现有技术中morpholino只能短期降低生物体内基因的表达的技术问题。

2、第一方面，本申请提供了一种ttc21b基因突变位点，所述位点位于ttc21b基因的第6号外显子靶位点，所述第6号外显子靶位点的核苷酸序列如seq id no.1所示；

3、所述基因突变位点由crispr/cas9基因编辑技术敲除。

4、可选的，所述第6号外显子靶位点的打靶sgrna引物序列包括：第6号外显子靶位点核苷酸互补序列、sgrna骨架序列和t7启动子序列，所述sgrna骨架序列设于所述第6号外显子靶位点核苷酸互补序列的3’端，所述t7启动子序列设于所述第6号外显子靶位点核苷酸互补序列的5’端；

5、

6、所述打靶sgrna引物序列如seq id no.5所示。

7、第二方面，本申请提供了一种检测ttc21b基因突变位点的引物组，所述引物组用于检测第一方面所述的基因突变位点，所述引物组包括检测所述第6号外显子靶位点的检测引物对。

8、可选的，所述检测引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，所述检测引物对的下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、第三方面，本申请提供了一种ttc21b基因突变位点的应用，所述应用包括将第一方面所述的基因突变位点作为构建ttc21b基因敲除动物模型的敲除位点中。

10、可选的，所述动物模型的构建方法包括：

11、针对第一方面所述的基因突变位点设计打靶sgrna引物；

12、根据所述打靶sgrna引物进行pcr扩增，以得到gdna；

13、将所述gdna和pt3-cas9质粒进行体外转录，以得到针对ttc21b基因的sgrna和cas9mrna的混合物；

14、使用sgrna和cas9mrna的混合物注射入单细胞期受精卵中，以实现cas9蛋白对ttc21b基因进行剪切并使ttc21b基因产生dna双链断裂，后通过dna修复，得到含突变dna的动物模型；

15、饲养并筛选所述含突变dna的动物模型，得到ttc21b基因缺失的动物模型。

16、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

17、本申请实施例提供的一种ttc21b基因缺失位点，通过针对ttc21b基因第6号外显子靶位点的核苷酸序列进行设计，可以配合crispr/cas9基因编辑技术对第6号外显子靶位点进行精准敲除，从而可以使得ttc21b基因在第6号外显子靶位点产生基因突变，敲除后在翻译过程提前引入终止密码子，使得ttc21b基因的翻译提前终止并形成异常的截短蛋白，长期降低生物体内ttc21b基因的表达。

技术特征：

1.一种ttc21b基因突变位点，其特征在于，所述基因突变位点位于ttc21b基因的第6号外显子靶位点，所述第6号外显子靶位点的核苷酸序列如seq id no.1所示；

2.根据权利要求1所述的基因突变位点，其特征在于，所述第6号外显子靶位点的打靶sgrna引物序列包括：第6号外显子靶位点核苷酸互补序列、sgrna骨架序列和t7启动子序列，所述sgrna骨架序列设于所述第6号外显子靶位点核苷酸互补序列的3’端，所述t7启动子序列设于所述第6号外显子靶位点核苷酸互补序列的5’端；

3.一种检测ttc21b基因突变位点的引物组，其特征在于，所述引物组用于检测如权利要求1或2所述的基因突变位点，所述引物组包括检测所述第6号外显子靶位点的检测引物对。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述检测引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，所述检测引物对的下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

5.一种ttc21b基因突变位点的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求1-5任一项所述的基因突变位点作为构建ttc21b基因敲除动物模型的敲除位点中。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述动物模型的构建方法包括：

技术总结本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种ttc21b基因突变位点及其应用；所述基因突变位点包括ttc21b基因的第6号外显子靶位点，第6号外显子靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；通过设计靶向ttc21b基因的第6号外显子的sgRNA，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除ttc21b基因，使ttc21b基因翻译提前终止并形成异常的截短蛋白，长期降低生物体内ttc21b基因的表达。技术研发人员：周建华,杨媛,邓林霞,尹晓玲,周兰琪,熊博,张瑜受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属同济医院技术研发日：技术公布日：2024/10/17