合成紫黄质及其衍生物的重组大肠杆菌及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物，涉及一种合成紫黄质及其衍生物的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、类胡萝卜素(carotenoids)是一类最重要的天然色素，具有重要的生理功能和多种潜在应用价值。其中黄叶素类化合物(xanthophylls)是一大类类胡萝卜素，存在于多种生物体中，在植物和藻类的光捕获和光保护过程中起着特别重要的作用。微生物细胞工厂因其生产周期短、环境友好以及能够利用可持续资源等优点而被广泛用于生产多种天然产物。使用代谢工程微生物生产类胡萝卜素作为当前从天然来源提取和化学合成过程的替代途径而备受关注。代谢工程方法已成功实现几种重要类胡萝卜素(包括番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素)的高产微生物。

2、紫黄质(violaxanthin)是一种重要的植物来源的黄叶素，因为它的抗氧化活性和亮黄色，使其在药物、食品和化妆品中具有潜在的应用价值。紫黄质是植物中重要的类胡萝卜素类化合物。紫黄质是脱落酸、岩藻黄质、辣椒红素的关键前体，它参与了植物中的黄叶素循环。紫黄质主要分布在蕨类植物、苔藓植物和种子植物的叶、花、果实中。与β-胡萝卜素(β-carotene)和叶黄素(lutein)相比，紫黄质具有更强的抗氧化能力。紫黄质还被证明具有抗癌、抗炎和其他生物活性。因而，紫黄质在医药、食品、化妆品等产品中具有很大的应用价值。由于紫黄质在植物中含量低，很难通过植物提取获得。而采用微生物进行异源合成，目前主要受限于其合成水平低，难以进行工业应用。在酿酒酵母中，紫黄质的产量约为7.3mg/g dcw。在大肠杆菌中，紫黄质的生产水平低于1mg/g dcw。紫黄质，cas no.为126-29-4，分子式为c40h56o4，分子量为600.87。

3、玉米黄素也是类胡萝卜素的一种，在自然界中广泛存在于黄色或橙色的水果、蔬菜等植物及微藻中。它可参与植物的黄叶素循环，保护植物免受光损伤。玉米黄素除了可以作为天然着色剂外，还具有抗氧化、抗癌、保护视力等生理活性，可应用在食品、医保、化妆品等领域。植物中玉米黄素含量较低，且从植物中提取工艺复杂，产率低。因此开发微生物异源合成玉米黄素成为一种可行的替代方法，但由于产量低，无法应用于工业生产。玉米黄素，别名为玉米黄质，cas no.为144-68-3，分子式为c40h56o2，分子量为568.871。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种合成紫黄质及其衍生物的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

2、本发明提供了一种重组大肠杆菌(大肠杆菌甲)，是将大肠杆菌进行多项改造得到的。

3、本发明还提供了一种构建紫黄质产量提高的重组大肠杆菌的方法(方法甲)，包括如下步骤：将大肠杆菌进行多项改造。大肠杆菌甲为用于制备紫黄质的大肠杆菌。

4、所述大肠杆菌甲或所述方法甲中：所述多项改造包括改造(a)和/或改造(b)和/或改造(c)和/或改造(e)；

5、改造(a)：导入并表达mvas基因、mvae基因和mvk基因；

6、改造(b)：导入并表达crtb基因、crti基因、crte基因和idi基因；

7、改造(c)：导入并表达zep基因、crty基因和crtz基因；

8、改造(e)：导入并表达pmk基因和mvd基因。

9、所述大肠杆菌甲或所述方法甲中：所述多项改造包括改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(e)。

10、所述大肠杆菌甲或所述方法甲中：所述多项改造还包括改造(h)和/或改造(i)；

11、改造(h)：敲除gor基因；改造(i)：敲除trxb基因。

12、所述大肠杆菌甲或所述方法甲中：所述多项改造包括改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(e)和改造(h)和改造(i)。

13、所述大肠杆菌甲或所述方法甲中：所述多项改造还包括改造(d)；

14、改造(d)：导入并表达fd基因和fnr基因。

15、所述大肠杆菌甲或所述方法甲中：所述多项改造还包括改造(f)和/或改造(g)和/或改造(j)；

16、改造(f)：敲除lpxm基因；改造(g)：敲除poxb基因；改造(j)：敲除ldha基因。

17、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(d)和改造(e)和改造(h)和改造(i)组成。

18、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(d)和改造(h)和改造(i)组成。

19、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(d)和改造(e)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)和改造(j)组成。

20、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(d)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)组成。

21、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(e)和改造(h)和改造(i)组成。

22、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(h)和改造(i)组成。

23、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(e)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)和改造(j)组成。

24、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)组成。

25、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(e)组成。

26、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)组成。

27、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(e)和改造(f)和改造(g)和改造(j)组成。

28、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(c)和改造(f)和改造(g)组成。

29、本发明还保护所述大肠杆菌甲或所述方法甲在制备紫黄质中的应用。

30、本发明还保护一种重组大肠杆菌(大肠杆菌乙)，是将大肠杆菌进行多项改造得到的。大肠杆菌乙为用于制备玉米黄素的大肠杆菌。

31、本发明还保护一种构建玉米黄素产量提高的重组大肠杆菌的方法(方法乙)，包括如下步骤：将大肠杆菌进行多项改造。

32、所述大肠杆菌乙或所述方法乙中：所述多项改造包括改造(a)和/或改造(b)和/或改造(k)和/或改造(e)；

33、改造(a)：导入并表达mvas基因、mvae基因和mvk基因；

34、改造(b)：导入并表达crtb基因、crti基因、crte基因和idi基因；

35、改造(k)：导入并表达crty基因和crtz基因；

36、改造(e)：导入并表达pmk基因和mvd基因。

37、所述大肠杆菌乙或所述方法乙中：所述多项改造包括改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(e)。

38、所述大肠杆菌乙或所述方法乙中：所述多项改造还包括改造(h)和/或改造(i)；

39、改造(h)：敲除gor基因；改造(i)：敲除trxb基因。

40、所述大肠杆菌乙或所述方法乙中：所述多项改造包括改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(e)和改造(h)和改造(i)。

41、所述大肠杆菌乙或所述方法乙中：所述多项改造还包括改造(d)；

42、改造(d)：导入并表达fd基因和fnr基因。

43、所述大肠杆菌乙或所述方法乙中：所述多项改造还包括改造(f)和/或改造(g)和/或改造(j)；

44、改造(f)：敲除lpxm基因；改造(g)：敲除poxb基因；改造(j)：敲除ldha基因。

45、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(d)和改造(e)和改造(h)和改造(i)组成。

46、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(d)和改造(h)和改造(i)组成。

47、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(d)和改造(e)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)和改造(j)组成。

48、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(d)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)组成。

49、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(e)和改造(h)和改造(i)组成。

50、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(h)和改造(i)组成。

51、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(e)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)和改造(j)组成。

52、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(f)和改造(g)和改造(h)和改造(i)组成。

53、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(e)组成。

54、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)组成。

55、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(e)和改造(f)和改造(g)和改造(j)组成。

56、具体的，所述多项改造由改造(a)和改造(b)和改造(k)和改造(f)和改造(g)组成。

57、本发明还保护所述大肠杆菌乙或所述方法乙在制备玉米黄素中的应用。

58、以上任一所述重组大肠杆菌或任一所述方法中：敲除lpxm基因，具体可为敲除lpxm基因编码框。

59、以上任一所述重组大肠杆菌或任一所述方法中：敲除poxb基因，具体可为敲除poxb基因编码框。

60、以上任一所述重组大肠杆菌或任一所述方法中：敲除gor基因，具体可为敲除gor基因编码框。

61、以上任一所述重组大肠杆菌或任一所述方法中：敲除trxb基因，具体可为敲除trxb基因编码框。

62、以上任一所述重组大肠杆菌或任一所述方法中：敲除ldha基因，具体可为敲除ldha基因编码框。

63、lpxm基因编码框如genbank accession number nc_000913.3(09-mar-2022)中第1939222-1940193位所示；大肠杆菌lpxm基因的geneid为945143，编码的蛋白质如genbankaccession number np_416369.1(09-mar-2022)所示。

64、poxb基因编码框如genbank accession number nc_000913.3(09-mar-2022)中第909331-911049位所示；大肠杆菌poxb基因的geneid为946132，编码的蛋白质如genbankaccession number np_415392.1(09-mar-2022)所示。

65、gor基因编码框如genbank accession number nc_000913.3(09-mar-2022)中第3646299-3647651位所示；大肠杆菌gor基因的geneid为948014，编码的蛋白质如genbankaccession number np_417957.1(09-mar-2022)所示。gor基因编码谷胱甘肽还原酶。

66、trxb基因编码框如genbank accession number nc_000913.3(09-mar-2022)中第931085-932050位所示(模板链)；大肠杆菌trxb基因的geneid为949054，编码的蛋白质如genbank accession number np_415408.1(09-mar-2022)所示。trxb基因编码铁氧化还原蛋白还原酶。

67、ldha基因编码框如genbank accession number nc_000913.3(09-mar-2022)中第1441854-1442843位所示。大肠杆菌ldha基因的geneid为946315，编码的蛋白质如genbankaccession number np_415898.1(09-mar-2022)所示。

68、改造(a)具体可为：将用于表达mvas基因、mvae基因和mvk基因的dna分子整合至大肠杆菌的基因组dna中。所述整合的位置具体可为大肠杆菌基因组dna中的lpxm位点。所述整合可以通过插入大肠杆菌基因组dna中的lpxm基因实现，也可以通过取代大肠杆菌基因组dna中的lpxm基因编码框或其部分区段实现。

69、改造(a)和改造(f)可同时完成，即：将大肠杆菌基因组dna中的lpxm基因编码框替换为用于表达mvas基因、mvae基因和mvk基因的dna分子。

70、用于表达mvas基因、mvae基因和mvk基因的dna分子具体可为mv片段。mv片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：kan残留区段、parabad启动子、mvas基因、rbs1、mvae基因、rbs1、mvk基因和trrnb终止子。

71、改造(a)和改造(f)具体利用lp-mv片段、pkd46质粒和pcp20质粒实现。lp-mv片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：lpxmup区段、kan相关区段、parabad启动子、mvas基因、rbs1、mvae基因、rbs1、mvk基因、trrnb终止子和lpxmdown区段。

72、改造(b)具体可为：将用于表达crtb基因、crti基因、crte基因和idi基因的dna分子整合至大肠杆菌的基因组dna中。所述整合的位置具体可为大肠杆菌基因组dna中的poxb位点。所述整合可以通过插入大肠杆菌基因组dna中的poxb基因实现，也可以通过取代大肠杆菌基因组dna中的poxb基因编码框或其部分区段实现。

73、改造(b)和改造(g)可同时完成，即：将大肠杆菌基因组dna中的poxb基因编码框替换为用于表达crtb基因、crti基因、crte基因和idi基因的dna分子。

74、用于表达crtb基因、crti基因、crte基因和idi基因的dna分子具体可为ct片段。ct片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：kan残留区段、ptac启动子、rbs2、crtb基因、rbs3、crti基因、rbs4、crte基因、rbs5、idi基因和tl3终止子。

75、改造(b)和改造(g)具体利用px-ct片段、pkd46质粒和pcp20质粒实现。px-ct片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：poxbup区段、kan相关区段、ptac启动子、rbs2、crtb基因、rbs3、crti基因、rbs4、crte基因、rbs5、idi基因、tl3终止子和poxbdown区段。

76、改造(c)具体可为：将用于表达zep基因、crty基因和crtz基因的dna分子或者具有该dna分子的重组表达载体导入大肠杆菌。

77、用于表达zep基因、crty基因和crtz基因的dna分子具体可为yzz片段。yzz片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：d0调控元件、zep基因、d1调控元件、crty基因、d2调控元件、crtz基因和trrnb终止子。具有yzz片段的重组表达载体具体可为重组质粒ps-yzz。重组质粒ps-yzz为双链dna分子组成的环形质粒，由如下两个区段组成：yzz片段和ps片段。

78、改造(k)具体可为：将用于表达crty基因和crtz基因的dna分子或者具有该dna分子的重组表达载体导入大肠杆菌。

79、用于表达crty基因和crtz基因的dna分子具体可为yz片段。yz片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：d1调控元件、crty基因、d2调控元件、crtz基因和trrnb终止子。具有yz片段的重组表达载体具体可为重组质粒ps-yz。重组质粒ps-yz为双链dna分子组成的环形质粒，由如下两个区段组成：yz片段和ps片段。

80、改造(d)具体可为：将用于表达fd基因和fnr基因的dna分子或者具有该dna分子的重组表达载体导入大肠杆菌。

81、用于表达fd基因和fnr基因的dna分子具体可为ctrfd-fnr片段。ctrfd-fnr片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：rbs6、fd基因、rbs6、fnr基因和trrnb终止子。具有ctrfd-fnr片段的重组表达载体具体可为重组质粒pl-fdn。重组质粒pl-fdn为双链dna分子组成的环形质粒，由如下两个区段组成：ctrfd-fnr片段和pl片段。

82、改造(h)，即：将大肠杆菌基因组dna中的gor基因编码框替换为了kan残留区段。

83、改造(h)具体利用kan-g片段、pkd46质粒和pcp20质粒实现。kan-g片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：gorup片段、kan相关区段和gordown片段。

84、改造(i)，即：将大肠杆菌基因组dna中的trxb基因编码框替换为了kan残留区段。

85、改造(i)具体利用kan-t片段、pkd46质粒和pcp20质粒实现。kan-t片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：trxbup片段、kan相关区段、trxbdown片段。

86、改造(e)具体可为：将用于表达pmk基因和mvd基因的dna分子整合至大肠杆菌的基因组dna中。所述整合的位置具体可为大肠杆菌基因组dna中的ldha位点。所述整合可以通过插入大肠杆菌基因组dna中的ldha基因实现，也可以通过取代大肠杆菌基因组dna中的ldha基因编码框或其部分区段实现。

87、改造(e)和改造(j)可同时完成，即：将大肠杆菌基因组dna中的ldha基因编码框替换为用于表达pmk基因和mvd基因的dna分子。

88、用于表达pmk基因和mvd基因的dna分子具体可为pmk-mvd片段。pmk-mvd片段为双链dna分子，自上游至下游依次由如下区段组成：p119启动子、rbs1、pmk基因、rbs1、mvd基因和trrnb终止子。

89、p119启动子如seq id no：1所示。rbs1如seq id no：2所示。trrnb终止子如seq idno：3所示。lpxmup区段如seq id no：4所示。lpxmdown区段如seq id no：5所示。kan相关区段如seq id no：6所示。parabad启动子如seq id no：7所示。poxbup区段如seq id no：8所示。poxbdown区段seq id no：9所示。ptac启动子如seq id no：10所示。tl3终止子如seq idno：11所示。rbs2如seq id no：12所示。rbs3如seq id no：13所示。rbs4如seq id no：14所示。rbs5如seq id no：15所示。d0调控元件如seq id no：16所示。d1调控元件如seq id no：17所示。d2调控元件如seq id no：18所示。ps片段为双链dna分子，如seq id no：19所示。gorup片段如seq id no：20所示。gordown片段如seq id no：21所示。trxbup片段如seq idno：22所示。trxbdown片段如seq id no：23所示。rbs6如seq id no：24所示。pl片段为双链dna分子，如seq id no：25所示。kan残留区段如seq id no：26所示。

90、pmk基因如genbank accession number nm_001182727.1(13-jan-2023)所示；pmk基因编码的蛋白质如genbank accession number np_013947.1(13-jan-2023)所示，来源于saccharomyces cerevisiae。pmk基因编码甲羟戊酸磷酸激酶。

91、mvd基因如genbank accession number nm_001183220.1(13-jan-2023)所示；mvd基因编码的蛋白质如genbank accession number np_014441.1所示(13-jan-2023)，来源于saccharomyces cerevisiae。mvd基因编码甲羟戊酸脱羧酶。

92、mvas基因如genbank accession number af290092.1(29-aug-2000)中第142-1293位所示；mvas基因编码的蛋白质如genbank accession number aag02438.1(29-aug-2000)所示，来源于enterococcus faecalis。mvas基因编码3-羟基-3-甲基戊二酰-coa合成酶。

93、mvae基因如genbank accession number af290092.1(29-aug-2000)中第1479-3890位所示；mvae基因编码的蛋白质如genbank accession number aag02439.1(29-aug-2000)所示，来源于enterococcus faecalis。mvae基因编码乙酰辅酶a乙酰基转移酶。

94、mvk基因如genbank accession number mh084473.1(14-jan-2019)中第1-906位所示；mvk基因编码的蛋白质如genbank accession number azw07554.1(14-jan-2019)所示。mvk基因编码甲羟戊酸激酶。

95、crtb基因如genbank accession number d90087.2(05-aug-2008)中第5057-5986位所示；crtb基因编码的蛋白质如genbank accession number baa14128.2(05-aug-2008)所示，来源于pantoea ananatis。crtb基因编码八氢番茄红素合成酶。

96、crti基因如genbank accession number d90087.2(05-aug-2008)中第3582-5060位所示；crti基因编码的蛋白质如genbank accession number baa14127.1(05-aug-2008)所示，来源于pantoea ananatis。crti基因编码八氢番茄红素脱氢酶。

97、crte基因如genbank accession number d90087.2(05-aug-2008)中第225-1133位所示；crte基因编码的蛋白质如genbank accession number baa14124.1(05-aug-2008)所示，来源于pantoea ananatis。crte基因编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶。

98、idi基因如genbank accession number nc_000913.3(09-mar-2022)中第3033065-3033613位所示；idi基因编码的蛋白质如genbank accession number np_417365.1(09-mar-2022)所示，来源于escherichia coli。

99、zep基因如genbank accession number xm_047407391.1(05-apr-2022)中第408-2393位所示；zep基因编码的蛋白质如genbank accession number xp_047263347.1(05-apr-2022)所示，来源于capsicum annuum。zep基因编码玉米黄素环氧化酶。

100、crty基因如genbank accession number cp077368.1(28-jun-2021)中第191390-192550位所示；crty基因编码的蛋白质如genbank accession number qxb60949.1(28-jun-2021)所示，来源于pantoea agglomerans。crty基因编码番茄红素β-环化酶。

101、crtz基因如genbank accession number hq003247.1(09-jan-2011)中第111-638位所示；crtz基因编码的蛋白质如genbank accession number adu76136.1(09-jan-2011)所示，来源于pantoea agglomerans。crtz基因编码β-胡萝卜素羟化酶。

102、fd基因如genbank accession number ae006470.1(31-jan-2014)中第1184476-1184664位所示；fd基因编码的蛋白质如genbank accession number aam72491.1(31-jan-2014)所示，来源于chlorobaculum[tepidum。

103、fnr基因如genbank accession number ae006470.1(31-jan-2014)中第1418760-1419842位所示；fnr基因编码的蛋白质如genbank accession number aam72739.1(31-jan-2014)所示，来源于chlorobaculum[tepidum。

104、fd基因编码的蛋白和fnr基因编码的蛋白属于铁氧还蛋白-fnr(ferredoxin:nadp+oxidoreductase)电子转移系统。

105、所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌g01或大肠杆菌bw25113。

106、紫黄质的生物合成需要通用的类胡萝卜素前体异戊烯基二磷酸(ipp)和二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)，它们由甲羟戊酸(mva)途径或甲基赤藓糖醇4-磷酸(mep)途径提供。ipp和dmapp的缩合导致形成中间体法尼基二磷酸(fpp,c15)。番茄红素是以法尼基二磷酸为前体通过法尼基二磷酸合酶(fpps)、香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps、crte)、八氢番茄红素合酶(psy、crtb)和八氢番茄红素去饱和酶(pds、crti)催化的连续反应生物合成的。从番茄红素合成紫黄质还需要三个步骤。番茄红素首先被番茄红素β-环化酶(lcyb，crty)环化形成β-胡萝卜素，然后β-胡萝卜素被β-胡萝卜素3-羟化酶(chyb，crtz)转化为玉米黄质。紫黄质最终被玉米黄质环氧酶(zep)氧化形成玉米黄质。

107、本发明制备了可以高产紫黄质和玉米黄质的重组大肠杆菌，提高目标物产量的同时降低了副产物产量，解决了两者产业生产中的瓶颈问题，可用于紫黄质和玉米黄质产业以及下游衍生物产业的大量生产，具有重大的应用推广前景。