2,6-吡啶二羧酸产量提高的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其应用

本发明属于分子生物学，具体涉及一株2,6-吡啶二羧酸产量提高的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其应用。

背景技术：

1、全球每年因植物病害导致的经济损失巨大，而全球变暖导致病原菌生态位向高纬度地区移动，植物病害及其导致的损失愈加严重。长期施用农药会使病菌产生抗药性，而且会造成农药残留、环境污染、危害人类健康等问题，绿色防控技术由此提出并受到广泛关注。和生防真菌相比，生防细菌更易进行大量生产和遗传改造，利用生防细菌对植物真菌病害进行防治已成为生物防治领域的重要手段。在生防细菌领域，芽胞杆菌属是革兰氏阳性菌中最重要的种属之一，其中枯草芽胞杆菌是一种普遍存在的环境细菌。枯草芽胞杆菌168是一种模式菌株，遗传信息明确，易于进行分子改造从而大量合成目的产物。但是野生型枯草芽胞杆菌168定殖能力较差，且已知的抗菌代谢产物较少，限制了该菌株作为生物防治剂的应用。

2、宋雪歌等人从枯草芽胞杆菌168的发酵液中分离出一种新的抗真菌次级代谢物——2,6-吡啶二羧酸（dpa），对多种植物病原菌表现出广谱抗真菌活性。dpa作为一种天然产物，是微生物、辅酶、生物碱的氧化降解产物，在植物表面易降解、无残留，具有环境兼容性好的特点。然而，野生型168菌株的dpa产量极低，无法满足应用需求，亟需开发有效的分子改造手段提高重组菌株的dpa产量，从而提高重组菌株的生防效用。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一株2,6-吡啶二羧酸产量提高的枯草芽胞杆菌基因工程菌。所述基因工程菌是将转录调控因子spo0a转入枯草芽胞杆菌（ bacillus subtilis）168得到基因工程菌，所述转录调控因子spo0a的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2、本发明的目的之二是提供上述基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤1，将转录调控因子spo0a的基因序列插入到表达质粒上，得到重组质粒；

4、步骤2，将步骤1得到的重组质粒转化枯草芽胞杆菌（ bacillus subtilis）168得到。

5、其中，步骤1中所述表达质粒为pma5。

6、本发明的目的之三是提供上述基因工程菌在发酵生产2,6-吡啶二羧酸中的应用。

7、利用该基因工程菌进行发酵的培养条件如下：

8、菌株活化方法如下：使用lb液体培养基，培养条件37℃，200 r/min，ph = 7.0-7.2。

9、种子培养方法如下：利用含有50 ml lb培养基的250 ml锥形瓶进行种子培养，培养条件37°c，200 r/min，培养至od600= 2.0。

10、发酵培养方法如下：取10 ml种子培养物，8,000 × g、4℃离心10 min后，将收集的细胞加入装液量为100 ml lb培养基的250 ml锥形瓶中进行发酵培养。培养条件为37℃，200 r/min，好氧振荡培养72 h。

11、本发明的目的之四是提供一种防制甘薯黑斑病的产品，其活性成分采用上述基因工程菌发酵得到。

12、本领域的技术人员可以对上述培养条件或培养基配方进行调整。

13、有益效果

14、与现有技术相比，本发明在枯草芽胞杆菌168菌株中以表达载体组成型质粒pma5过表达枯草芽胞杆菌内源的转录调控因子spo0a，得到重组菌株，能够实现在发酵过程中提高葡萄糖消耗速率、菌体生长速率和dpa产量。本发明分子操作简单，无需经过长期的进化过程，是提高枯草芽胞杆菌dpa发酵性能的一种尝试。

技术特征：

1. 一株2,6-吡啶二羧酸产量提高的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将转录调控因子spo0a转入枯草芽胞杆菌（bacillus subtilis）168得到，所述转录调控因子spo0a的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述表达质粒为pma5。

4.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产2,6-吡啶二羧酸中的应用。

5.一种防制甘薯黑斑病的产品，其特征在于，其活性成分包括采用发酵后的权利要求1所述基因工程菌。

技术总结本发明公开了一株2,6‑吡啶二羧酸产量提高的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其应用。所述基因工程菌是将转录调控因子spo0A转入枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）168得到基因工程菌，所述转录调控因子spo0A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过在枯草芽胞杆菌168菌株中以表达载体组成型质粒pMA5过表达枯草芽胞杆菌内源的转录调控因子spo0A，得到重组菌株，能够实现在发酵过程中提高葡萄糖消耗速率、菌体生长速率和DPA产量。技术研发人员：施欣驰,杨阳,张宇晶,赖雅洁,拉博德·佩德罗,王苏妍受保护的技术使用者：南通大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14