一种比色内毒素传感检测方法

本发明涉及快检，涉及一种比色内毒素传感检测方法，具体涉及一种内毒素传感检测试剂和纸基比色内毒素传感检测方法。

背景技术：

1、临床上在进行静脉滴注大量输液时，如果药液中含有热原，病人会在0.5～1h内出现冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，高热时体温可达40℃，严重者甚至会休克，这种现象称为热原反应。引起热原反应的主要原因是注射液或输液器中污染的热原所引起的。热原是指注射进入人体或动物体内后，能导致其体温升高的一类物质总称，可分为外源性热原和内源性热原。细菌内毒素是一种最广泛的外源性热原。内毒素是革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁的一种成分，叫做脂多糖(lps)。脂多糖对宿主是有毒性的，其毒性成分主要为类脂质a。虽然内毒素紧密地嵌入细胞壁中，但也会不断地向周围环境释放内毒素，这种释放发生在正常细胞生长和分裂、细胞的解体和死亡过程中。输注用药品、输注用医疗器械等的细菌内毒素含量过高，若进入人体血液循环，会引起发热、血压降低、寒颤等一系列临床反应，严重时会引起播散性血管内凝血(dic)、多器官功能障碍综合征、内毒素休克、内毒素败血症等，危及生命。因此内毒素快速定量检测不仅有助于鉴别是否为细菌感染，尤其是对于革兰阴性杆菌感染具有重要的参考价值，还能提示感染严重程度，可用于发热原因的快速辅助诊断；有利于临床及早诊治疾病，为选择用药提供一定理论依据，对病情进行动态监测，对给药后的疗效及预后判断具有重大意义；用于血液透析液的监测，对于保证治疗效果和患者安全有着重要作用。总而言之，内毒素的快速定量检测对临床对症治疗具有重要的现实意义。

2、目前内毒素测定方法有鲎试剂法、脂多糖(lps)的生物学标记的探测分析法、酶联免疫测定法(elisa)、生物传感器检测法等。酶联免疫测定法(elisa)是目前新兴的内毒素检测方法，它是基于抗原抗体的酶联免疫测定法，由外加热原质刺激巨噬细胞后产生的内热原物质如肿瘤坏死(tnf)因子白细胞介素1(il-1)等而进行测定的；生物传感器检测法也是目前新兴的内毒素检测方法，包括光学、电化学和荧光生物传感器。其中，lps定量主要基于lps与天然或人工识别分子如多肽、抗体、特异性适配体、等离子纳米颗粒与靶标分子之间的亲和力实现检测。然而，由于成本高且实时跟踪困难，目前绝大多数生物传感器检测法多数正处于研究试验阶段，还未能在市场上广泛应用。

3、现有技术的生物传感器检测法存在如下缺陷：

4、(1)荧光法的选择性好、检出限低，但是需要荧光标记的分子或纳米颗粒，并且检测器件不便携。

5、(2)化学发光法和电化学法虽然在检测灵敏性、选择性上有一定的优势，但化学发光法时间和空间的可控性差，容易产生假阳性结果。

6、(3)电化学法还存在电极易污染以及背景信噪比高等问题。

7、现有技术中没有通过ctab介导的金纳米颗粒的颜色变化检测内毒素的相关报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种内毒素传感检测试剂和方法，该检测试剂可以实现对内毒素的准确定量检测。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、本发明首先提供一种内毒素传感检测试剂，所述的试剂由金纳米颗粒(aunps)、磁珠(mb)、dna、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)组成，其中，磁珠、dna和ctab的摩尔比为：1-5：25-50：10-20；优选为：1：25：20；

4、所述金纳米颗粒的质量浓度为0.02～0.1mg/ml，优选为0.08mg/ml。

5、进一步地，所述的dna为5’-生物素修饰的dna；

6、所述dna的序列如seq id no.1所示。

7、本发明提供一种内毒素传感检测方法，该方法根据阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(ctab)介导的金纳米颗粒在试纸上的颜色变化进行内毒素含量测定，当样品中有内毒素存在时，在表面活性剂作用下，金纳米颗粒会被表面活性剂包覆而发生聚集，由于金纳米颗粒的独特光学特性导致此时溶液的颜色由红色向蓝色转变。通过颜色的深浅和荧光光谱联用可实现对内毒素的准确定量检测。

8、本发明的内毒素传感检测方法包括如下步骤：

9、步骤一：取磁珠溶液，用磁铁吸附磁珠，去掉上清液后，加入dna在37℃孵育，hepes清洗去掉残留的dna，去掉上清液；

10、步骤二：将含有内毒素的样品溶液加入到步骤一的磁珠溶液中，37℃孵育。去掉上清液，再加入十六烷基三甲基溴化铵(ctab)水溶液，37℃孵育。收集上清液至另一个离心管中。

11、步骤三：向步骤二的离心管中加入aunps，观察颜色变化，并采用荧光光谱法测定内毒素含量。

12、或将步骤二中收集的上清液滴加至含有aunps反应位点的便携式纸基器件，等待3min反应后，拍照记录进行分析。

13、所述步骤一中，所述的dna为5’-生物素修饰的dna，序列如seq id no.1所示：aaaaaaaaaaaaccttctaacagaatgttgttagatagcaaaaaaaaaaaaccttcta acagaatgttgttagatagc

14、所述步骤一中，磁珠溶液的摩尔浓度为0.1～0.5μm；

15、所述步骤一中，dna的摩尔浓度为0.5～10μm，优选为2.5～5μm；

16、所述步骤二中，十六烷基三甲基溴化铵摩尔浓度为5nm～25μm，优选为1～4μm，更优选为1～2μm；

17、所述步骤三中，所述的便携式纸基器件为按照waterman滤纸、吸水纸、玻璃板从上到下的顺序依次排列组装得到的便携式纸基器件。waterman滤纸上滴有aunps反应位点，反应位点可以为一个或多个。

18、所述步骤三中，所述aunps的质量浓度为0.02～0.1mg/ml，优选为0.08mg/ml。

19、本发明还提供了一种内毒素传感检测的便携式纸基器件，所述的便携式纸基器件为waterman滤纸、吸水纸、玻璃板从上到下的顺序依次排列组装而成。粘连方式为用固体胶或胶水将吸水纸的四角粘在玻璃板上。

20、waterman滤纸上滴有aunps反应位点，反应位点可以为一个或多个，其结构示意图如图4所示，结构解剖示意图如图5所示。

21、本发明与现有技术相比，本发明将十六烷基三甲基溴化铵介导的金纳米颗粒用于内毒素的检测，同时将其设计成纸基比色传感器，不仅器件小巧，便携性好，不再完全依赖于实验室测紫外吸收光谱来收集和分析光学信号，克服了大型设备快速现场检测场合的应用限制，而且灵敏度高，实现了内毒素准确定量检测的目的，最小检出限为1.890μm。

技术特征：

1.一种内毒素传感检测试剂，其特征在于，由金纳米颗粒、磁珠、dna、十六烷基三甲基溴化铵组成，所述磁珠、dna、十六烷基三甲基溴化铵的摩尔比为：1-5：25-50：10-20，所述金纳米颗粒的质量浓度为0.02～0.1mg/ml。

2.权利要求1所述的内毒素传感检测试剂，其特征在于，所述dna为5’-生物素修饰的dna。

3.一种内毒素传感检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述dna为5’-生物素修饰的dna。

5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，磁珠溶液的摩尔浓度为0.1～0.5μm；dna的摩尔浓度为0.5～10μm，优选为2.5～5μm。

6.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，十六烷基三甲基溴化铵摩尔浓度为5nm～25μm，优选为1～4μm。

7.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述aunps的质量浓度为0.08mg/ml。

8.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，便携式纸基器件为按照waterman滤纸、吸水纸、玻璃板从上到下的顺序依次排列组装得到的便携式纸基器件，所述waterman滤纸上滴有aunps反应位点，反应位点可以为一个或多个。

9.一种内毒素传感检测的便携式纸基器件，其特征在于，按照waterman滤纸、吸水纸、玻璃板从上到下的顺序依次排列组装得到，所述waterman滤纸上滴有aunps反应位点，反应位点可以为一个或多个。

10.权利要求1或2所述的内毒素传感检测试剂或权利要求3-8任何一项所述的内毒素传感检测方法或权利要求9所述的内毒素传感检测的便携式纸基器件在内毒素检测中的应用。

技术总结本发明涉及一种内毒素传感检测方法，属于分析检测领域。所述的试剂由金纳米颗粒、磁珠、DNA、十六烷基三甲基溴化铵组成，其中，磁珠、DNA和CTAB的摩尔比为：1‑5：25‑50：10‑20；所述金纳米颗粒的质量浓度为0.02～0.1mg/mL。本发明的方法是根据阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵介导的金纳米颗粒在试纸上的颜色变化进行内毒素含量测定，当样品中有内毒素存在时，在表面活性剂作用下，金纳米颗粒会被表面活性剂包覆而发生聚集，由于金纳米颗粒的独特光学特性导致此时溶液的颜色由红色向蓝色转变。通过颜色的深浅和荧光光谱联用可实现对内毒素的准确定量检测。本方法灵敏度高，能够实现内毒素准确定量检测的目的，最小检出限为1.890μM。技术研发人员：戴溪,杨鎏,徐云慧,胡晗,柳峰,王再学,邓敏受保护的技术使用者：徐州工业职业技术学院技术研发日：技术公布日：2024/11/14