一种提升芽孢杆菌芽孢转化率的玉米浆干粉培养基及培养方法和应用

本发明属于生物工程，尤其是一种提升芽孢杆菌halalkalibacteriumhalodurans芽孢转化率的玉米浆干粉培养基及培养方法和应用。

背景技术：

1、在混凝土自修复中，微生物芽孢的作用非常重要。由于混凝土在水化过程中，其内部环境的ph值通常超过13，而适合微生物生长的ph值在6.5-9之间，因此混凝土的高碱性环境会大大降低微生物营养体的成活率。然而，与微生物营养细胞相比，芽孢具有特殊的生理结构，赋予其抗逆性强的特点，在极端条件下仍能够存活。因此，用于混凝土裂缝自修复的微生物需以芽孢的形式加入，并且水化后的混凝土为休眠的芽孢提供了一个相对干燥的封闭环境，使其可以长期存活其中。

2、菌株halalkalibacterium halodurans在微生物混凝土修复中具有重要作用，该菌能够产生碳酸酐酶，加快与空气中二氧化碳结合的速率，生成碳酸根离子，与底物钙离子相结合产生碳酸钙沉淀。此外，微生物的芽孢因其生理结构与功能的特性更能承受混凝土成型搅拌时的高速冲击力以及其内部强碱强盐环境。因此，将微生物以休眠体芽孢的形式与营养物以特定方式加入混凝土中进行修复研究，对微生物自修复的实现具有积极意义。

3、中国发明专利申请“cn202110458989.0一种枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法”公开了制备枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的方法，该方法菌种的活化传代时间代数多和芽孢培养培养基成分单一，该方法使用的营养成分单一，缺乏促进芽孢形成的营养物质，进而获得芽孢的时间长达8天。中国发明专利申请“cn201910504545.9一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生成培养基”公开了对一种嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢生产培养基，该培养基成分采用单一提纯后的组分作为营养成分，价格相对较高，而本发明专利申请采用玉米浆干粉作为营养氮源混合物，价格低廉，富含营养因子多。现有的培养基以及培养方法对菌株halalkalibacterium halodurans的芽孢转化率过低，目前在菌株高产芽孢的培养基方面研究较少，对该菌产芽孢的适配性低，是该菌株在混凝土自修复中进一步应用的一个难题，因此，通过优化菌株halalkalibacterium halodurans的培养基及培养方法，以获得较高芽孢产率具有重大的实用意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种提升芽孢杆菌halalkalibacterium halodurans芽孢转化率的玉米浆干粉培养基及培养方法和应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种提升芽孢杆菌halalkalibacterium halodurans芽孢转化率的玉米浆干粉培养基，所述培养基的配方包括：葡萄糖10-15g/l、玉米浆干粉5-10g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、碳酸钠10-15g/l、钙离子5-15mm、氯化钠4-6g/l，溶剂为水。

4、进一步地，所述钙离子所属化合物包括氯化钙、乙酸钙、硝酸钙、碳酸钙、氢氧化钙、氧化钙。

5、如上所述的玉米浆干粉培养基的配制方法，包括如下步骤：

6、葡萄糖10-15g/l、玉米浆干粉5-10g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、钙离子5-15mm、氯化钠4-6g/l，加入配置碳酸钠溶液剩余的水，经115℃灭菌处理30min，得高温灭菌后的培养基溶液；

7、使用部分水配置质量浓度为10％-15％的碳酸钠溶液，配置完成后需采用除高温灭菌外的灭菌方法对碳酸钠溶液进行灭菌；

8、将灭菌后碳酸钠溶液加入到高温灭菌后的培养基溶液温度，加入碳酸钠溶液，使用氢氧化钠调节ph至10.0-10.5。

9、进一步地，所述除高温灭菌外的灭菌方法包括过滤除菌、射线灭菌。

10、一种利用如上所述的玉米浆干粉培养基提升菌株halalkalibacteriumhalodurans芽孢转化率的培养方法，包括以下步骤：

11、(1)制备玉米浆干粉培养基；

12、(2)将菌株halalkalibacterium halodurans种子液接种至步骤(1)的培养基中发酵；

13、(3)待48-60h后镜检观察至视野中大于90％为芽孢时或发酵体系中出现白色沉淀物出现时停止发酵。

14、进一步地，所述步骤(2)中菌株halalkalibacterium halodurans种子液在培养时使用液体种子培养基培养，液体种子培养基用蒸馏水配制，其组成为葡萄糖8～10g/l、酵母浸粉3-5g/l、胰蛋白胨8-10g/l、磷酸氢二钾0.5-1g/l、碳酸钠10-15g/l，ph值9.5-10；其中，碳酸钠在添加前，首先碳酸钠需提前使用去离子水配置成质量浓度为10％-15％的碳酸钠溶液，配置完成后将碳酸钠溶液采用除高温灭菌外的灭菌方法进行灭菌后，再进行添加。除高温灭菌外的灭菌方法包括过滤除菌、射线灭菌的方法。该液体种子培养基的配制方法可以上述内容中玉米浆干粉培养基的配制方法。

15、进一步地，所述步骤(2)中接种种子液的生物量接入值需控制od600在1.0-2.0。

16、进一步地，所述步骤(2)中菌株halalkalibacterium halodurans的接种量为2-5％；

17、或者，所述步骤(2)中发酵时发酵温度为30-37℃，转速为150-200rpm。

18、进一步地，所述步骤(2)的具体步骤如下：

19、菌株halalkalibacterium halodurans种子液制备：取菌株halalkalibacteriumhalodurans甘油管，在种子液培养基平板上划线，37℃培养18h后，从平板上挑取单菌落于种子液液体培养基中，37℃培养约9h左右，od达到1-2即可接种，将菌株halalkalibacterium halodurans的种子液以2％-4％的接种量接种至装有步骤(1)的培养基中发酵，控制发酵温度37℃，转速200rpm。

20、如上所述的玉米浆干粉培养基在提升耐盐盐碱杆菌(halalkalibacteriumhalodurans)、耐盐芽孢杆菌(bacillus halodurans)、盐碱盐杆菌(alkalihalobacillushalodurans)的芽孢转化率中的应用。

21、如上所述的方法在提升耐盐盐碱杆菌(halalkalibacterium halodurans)、耐盐芽孢杆菌(bacillus halodurans)、盐碱盐杆菌(alkalihalobacillus halodurans)的芽孢转化率中的应用。

22、本发明取得的优点和积极效果为：

23、1、本发明培养基相比现有培养基中的含有的酵母浸粉和胰蛋白胨而言，降低了成本，加入了玉米浆干粉作为发酵底物，经济实惠，营养丰富，含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂肪和维生素等营养成分，能够满足微生物生长所需的营养需求，并且对环境友好，玉米浆干粉是一种可再生资源，其生产和使用对环境的影响较小。

24、2、本发明培养基引入钙离子，钙离子对于细菌营养体向芽孢的转化有着促进作用，不加入钙离子时芽孢数为7.8×108cfu/ml，活菌数为1.5×109cfu/ml，转化率为52％，加入钙离子后芽孢数为达到1.0×109cfu/ml以上，转化率也大于90％。

25、3、菌株halalkalibacterium halodurans在原始培养基芽孢转化过程中芽孢生成很少，芽孢生成的数量为3.7×104cfu/ml。对不同的营养成分探究发现，玉米浆干粉加入后对该菌株的芽孢生成具有显著性提升，并对其余营养成分探究以及培养方法的研究后，芽孢数由3.7×104cfu/ml提升至1.1×109cfu/ml以上，优化后的培养基芽孢转化率达到90％以上。玉米浆干粉作为底料，成本低，制作简单，能大幅提高该菌株产芽孢的能力，对菌株在不良环境中的生存有更加有利的影响。