一种覆膜封装菌丝球的方法

本发明属于环境微生物，具体涉及一种覆膜封装菌丝球的方法。

背景技术：

1、菌丝球是丝状真菌在生长发育过程中由水力剪切力定向作用于菌丝形成的表面致密、内部疏松的类球形菌丝聚集体，属于丝状真菌的特殊发酵形态。类球形的表观形态给予菌丝球许多优良特性，例如比表面积大、网状空隙多、传质性能好、沉降速度快、反应器相容性高、易于扩大化生产等，因此，菌丝球在液体发酵、废水处理、生物浸矿等领域得到越来越多的应用。

2、菌丝球是典型的天然环境友好材料，菌丝材质主要由几丁质、葡聚糖、纤维素、明胶组成，容易生物降解，不易在自然界中残留。但是与天然非生物材料或人工合成材料相比，菌丝球在废水处理、生物浸矿等相关反应器中运行时存在以下缺陷：

3、(1).菌丝球的机械强度不佳。当菌丝球以代谢特性为主进行生物浸矿或以吸附特性为主进行废水处理时，多以反应器为载体发生激烈的固液气三相反应，在此过程中菌丝球难以长期维持稳定的球体形态，致使批次反应时需频繁更换破损菌丝球，或连续反应时需排出破碎菌丝片段并重新启动系统，最终增加菌丝球反应器的运行时间与运营成本。

4、(2).菌丝球抵抗环境胁迫的能力欠佳。在以尾矿和废渣为目标进行生物浸矿，或以重金属废水为目标进行废水处理时，菌丝球所处反应器的内部多为高盐碱、低水活、强重金属毒性的生境，易对菌丝细胞造成胁迫，最终导致菌丝球膨胀碎裂、单位体积生物量降低，致使反应器处理效率降低，甚至导致系统崩溃。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种覆膜封装菌丝球的方法，该方法能够有效保护真菌菌丝，提升菌丝球的机械强度，强化菌丝球抵抗环境胁迫的能力，可以保持菌丝球长期维持稳定完整的球体形态，延长菌丝球的使用寿命，实现对菌丝球破损或缺陷区域的自修复和自封装。

2、本发明具体是通过以下技术方案来实现的，依据本发明提出的一种覆膜封装菌丝球的方法，包括以下步骤：

3、(1)配制活化培养基：所述的活化培养基以水为溶剂，按照重量百分数，其含有蔗糖2％、蛋白胨1％、酵母浸膏0.2％、k2hpo4 0.1％；

4、(2)取两个三角瓶，每个三角瓶中接入一定量步骤(1)的活化培养基，将其在高压灭菌锅中于121℃、103kpa灭菌20min；灭菌后将三角瓶冷却至室温，在一个三角瓶的活化培养基中接入蜡样芽孢杆菌，在另一个三角瓶的活化培养基中接入环状芽孢杆菌，两个三角瓶均用透气封口膜封口，于28～32℃、振荡条件或搅拌条件下培养48～72h，得到蜡样芽孢杆菌活化液和环状芽孢杆菌活化液；

5、(3)将一定量步骤(2)所得的蜡样芽孢杆菌活化液和环状芽孢杆菌活化液同时转接入盛有一定量已灭菌的覆膜液培养基的三角瓶中，三角瓶用透气封口膜封口，然后于28～32℃、振荡条件或搅拌条件下培养，培养72h后检测覆膜液中的多糖含量和覆膜液粘度，之后每隔24h检测一次，直至覆膜液中的多糖含量超过2.0g/l且覆膜液粘度超过200mpa·s时停止培养，得到活性覆膜液；

6、所述的覆膜液培养基以水为溶剂，按照重量百分数，其含有蔗糖1％、caco30.1％、mgso4 0.1％、fecl3 0.001％、k2hpo4 0.2％、al4[si4o10](oh)8 0.1％；

7、(4)将一定量孢子悬液接入步骤(3)所得活性覆膜液中，同时加入菌丝强化营养剂，三角瓶用透气封口膜封口，于28～32℃、振荡条件或搅拌条件或气提条件下培养72～96h，培养完成后，通过过滤将菌丝球和培养液分开，得到覆膜封装的菌丝球。

8、步骤(4)将孢子悬液直接接入活性覆膜液(含有细菌细胞)中，发育初期孢子在活性覆膜液中形成更多饱和晶核，从而促进菌丝球发育。由于覆膜液培养基为无氮基本培养基，菌丝生长时需进一步补充碳源、有机和无机氮源，因此在菌丝球培养阶段还投加含有碳源和氮源的菌丝强化营养剂。真菌孢子接入含细菌(蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌)细胞的活性覆膜液以后，细菌和真菌为共培养共发育过程，细菌细胞在生长过程中会合成并分泌代谢产物-胞外多聚物(eps)，当真菌经历孢子萌发、微观结构发育、宏观结构成型的过程时，培养液中原本存在的eps(由培养液中的细菌细胞代谢产生)及定殖于菌丝表面的细菌细胞代谢产生的eps持续包裹菌丝，实现eps对菌丝球发育全过程的覆膜封装。

9、前述的覆膜封装菌丝球的方法，步骤(3)中蜡样芽孢杆菌的接种体积与环状芽孢杆菌的接种体积比为(1～2):1。

10、前述的覆膜封装菌丝球的方法，步骤(3)中蜡样芽孢杆菌的接种体积与覆膜液培养基的体积比为1:(10～20)。

11、前述的覆膜封装菌丝球的方法，步骤(3)中覆膜液培养基的灭菌条件为121℃、103kpa灭菌20min。

12、前述的覆膜封装菌丝球的方法，步骤(4)中所述的孢子悬液的制备方法包括：将青霉孢子或其菌丝片段或者曲霉孢子或其菌丝片段于30～35℃在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基表面活化5～7d，然后将马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基表面的孢子用灭菌后的去离子水洗脱并制成孢子悬液，孢子悬液中青霉或曲霉的孢子数为1×108个/ml，使用前将孢子悬液摇匀。

13、进一步地，步骤(4)中孢子悬液的接种体积为活性覆膜液体积的1～2％。

14、前述的覆膜封装菌丝球的方法，步骤(4)中所述的菌丝强化营养剂包括蔗糖、酵母浸膏、nh4cl和nano3，其投加质量占活性覆膜液质量的百分数分别为：蔗糖10％、酵母浸膏2％、nh4cl 0.25％、nano3 0.15％。

15、进一步地，步骤(4)中在培养过程中在不同时间节点采用超声波振荡机或超声波均质机对培养液进行均质化处理，所述的不同时间节点分别为：刚加入孢子悬液和菌丝强化营养剂时、菌丝球平均直径为1mm时、菌丝球平均直径为2mm时、菌丝球平均直径为4mm时、菌丝球平均直径为8mm时、培养结束时；或者在刚加入孢子悬液和菌丝强化营养剂时对培养液进行超声波处理，然后每隔24h进行一次超声波处理，每次处理超声波震荡器的运行参数为：频率≤20khz，功率≤25mw/cm2，时间≤3s。本步骤采用低频低强度超声波震荡，有利于孢子均匀成核生成尺寸大小均一的菌丝球，还有利于活性覆膜液在空化气泡(超声波搅拌产生)作用下进入菌丝球内核的同时提升菌丝球表面与eps的黏合性能。完成活性eps覆膜封装的菌丝球内部及表面附着大量活性细菌(蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌)细胞，能够持续不断地分泌eps。

16、本发明还提供一种按照前述方法制备的覆膜封装的菌丝球及其在废水处理、生物浸矿中的应用。

17、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明可达到相当的技术进步性及实用性，并具有广泛的利用价值，其至少具有下列优点：

18、为解决废水处理或生物浸矿领域采用菌丝球反应器运行时菌丝球容易膨胀碎裂，难以长期维持稳定球体形态这一问题，本发明采用含有活性细菌细胞及其产生的胞外多聚物(eps)的活性覆膜液对菌丝球进行覆膜封装，从而提升菌丝球的机械强度，强化菌丝球抵抗环境胁迫的能力，使菌丝球长期保持稳定完整的球体形态，在生物浸矿、废水处理领域的工业化应用过程中能够增加菌丝球在批次反应时的循环批次数，或延长菌丝球在连续反应时的存活时间。

19、由于孢子萌发及菌丝发育的过程是在活性覆膜液中进行，因此活性细菌细胞及其产生的eps不仅附着于菌丝球表面，还能够定殖于菌丝球内部，从而实现对菌丝球物理空间及发育时间的全覆盖，有效提升菌丝球的机械强度和抵抗环境胁迫的能力。

20、完成覆膜封装的菌丝球内部及表面附着大量活性细菌(蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌)细胞，能够持续不断分泌eps。在实际应用过程中，当菌丝表面已覆膜封装区域在反应器运行时因搅拌、震荡等机械破坏效应或其他杂菌的代谢吞食效应而破裂损耗时，定殖于菌丝球表面及内部的活性细菌细胞能够分泌eps，从而填补修复菌丝表面的破损或缺陷区域，实现对破损或缺陷区域的自修复和自封装。

21、本发明采用含有细菌细胞的活性覆膜液对菌丝进行覆膜封装，能够在菌丝表面实现自生长、自覆膜及膜破损后的自修复功能，实现了eps对菌丝球空间全范围及发育全过程的自覆膜和自修复，具备稳定持久、绿色环保的有益效果。