一种普乐安片的检测方法

本发明属于药物分析，具体涉及一种普乐安片的检测方法。

背景技术：

1、良性前列腺增生症(benignprostatic hyperplasia，bph)是引起中老年男性排尿障碍的常见泌尿男科疾病，统计显示60岁男性bph发病率大于50％，80岁时达80％以上。bph主要表现为组织学上的前列腺间质和腺体成分增生、解剖学上的前列腺增大、尿动力学上的膀胱出口梗阻和下尿路症状(lower urinary tract symptoms，luts)。该病以尿频、尿急、夜尿频多为首发临床表现，严重影响患者的睡眠质量及日常活动。关于bph发病机制，学科内有这样几种假说：自身免疫性炎症、尿路上皮完整性和功能缺陷、前列腺隐匿性感染、排尿功能障碍、盆底肌肉痉挛/疼痛、神经内分泌紊乱、外周/中枢神经敏感化、神经重塑性、社会心理状况和遗传因素等，也有研究者提出前列腺微环境紊乱，即由免疫失调、氧化应激(oxidation stress，os)、疼痛因子释放等因素共同作用下导致的前列腺局部微环境紊乱可能是bph的重要发病机制。

2、目前bph患者治疗主要手段为手术切除和药物治疗。其中手术治疗有尿道前列腺等离子双极电切术(tupkp)和尿道等离子前列腺剜除术(tukep)，两种手术治疗均存在术后并发症：尿失禁约1～2.2％，逆行射精约65～70％，尿道狭窄约3.8％。常用治疗bph西药为α1-受体阻滞剂和5α-还原酶抑制剂，其中α1-受体阻滞剂适用于有中、重度下尿路症状的前列腺增生患者，常用药物：多沙唑嗪、特拉唑嗪、坦索罗辛。5α-还原酶是睾酮向双氢睾酮转变的还原酶，双氢睾酮在良性前列腺增生中有一定的作用，采用5α-还原酶抑制剂可以对增生予以一定的抑制，常用药物有：非那雄胺、度他雄胺。该类药物长期使用出现常见副作用包括头晕、头痛、乏力、困倦、体位性低血压、异常射精等。鉴于手术本身的局限性和现有药物治疗的副作用大等问题，中成药成为治疗bph的首选途径。

3、中医认为本病属于“精癃”、“癃闭”、“淋证”等范畴。中医古籍中既有许多对于癃闭的记载。《素问·五常政大论》称：“其病癃闭，邪伤肾也。”《灵枢经·本输》说：“三焦者…实则闭癃，虚则遗溺”。《素问·宣明五气》记述：“膀胱不利为癃，不约为遗溺”。《素问·标本病传论》认为：“膀胱病，小便闭”(张春和，2016)。中医认为bph的病因病机主要与肾虚气弱、淤血、湿热等因素密切相关，中医讲究辨证论治，治当活血化瘀、利湿通淋兼以补肾。开发和寻找方便、有效、低毒的中成药是治疗bph紧迫任务。

4、普乐安片是根据中医理论、经验及数十年临床应用验方基础上，形成了临床有效的纯中药复方制剂，是治疗前列腺增生症的国家级新药，该药以往的临床研究也印证了这一适应症。普乐安片是油菜花粉(blassikakapestris)制成，具有活血化瘀、清热通淋之功效。但其药效物质基础，即普乐安片的药效活性成分的种类并不明确，普乐安片中的活性成分含量的检测方法也尚不全面。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种普乐安片的检测方法，本发明提供的检测方法确定了普乐安片的药效活性成分的种类，并给出了普乐安片的药效活性成分含量的检测方法，能够作为普乐安片的质量控制指标。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种普乐安片的检测方法，包括以下步骤：

4、根据组成普乐安片的油菜花粉有效化学成分，采用网络药理学分析的方法获得普乐安片的复方中药网络药理图，根据所述普乐安片的复方中药网络药理图得到所述普乐安片的3种药效活性成分，所述3种药效活性成分分别为槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚；

5、将普乐安片用极性溶剂进行提取，得到的提取液除溶剂后得到待测样品；

6、将所述待测样品溶解于醇水溶剂中，得到待测样品溶液；

7、将所述待测样品溶液进行高效液相色谱检测，得到待测样品溶液的液相色谱图，由所述待测样品溶液的液相色谱图得到所述普乐安片中3种药效活性成分对应的峰面积；再由3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性拟合曲线或者线性回归方程得到所述普乐安片中3种药效活性成分的质量含量；

8、所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为水，流动相b为乙腈；采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：

9、

10、

11、优选的，所述高效液相色谱检测的条件还包括：柱温为30℃，流动相的流速为0.3ml·min-1。

12、优选的，所述高效液相色谱检测的条件还包括：检测波长为220～280nm。

13、优选的，溶解所述待测样品的醇水溶剂为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的质量百分含量为80wt％。

14、优选的，所述液相色谱检测中，所述待测样品溶液的进样量为1μl。

15、优选的，所述提取使用的极性溶剂为低碳醇或者低碳醇水溶液，所述低碳醇包括甲醇或者乙醇，所述低碳醇水溶液包括甲醇水溶液或者乙醇水溶液；所述低碳醇水溶液中低碳醇的质量百分含量为80％。

16、优选的，所述普乐安片和所述极性溶剂的料液比为1：(15～20)；所述提取在加热回流的条件下进行或者在超声的条件下进行。

17、优选的，所述3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性拟合曲线和线性回归方程的获得方法包括以下步骤：

18、将3种药效活性成分和标识物分别溶解于甲醇水溶剂中，所述标识物包括木犀草素和/或豆甾醇，分别得到3种药效活性成分和标识物的一系列不同质量浓度的标准溶液，分别将3种药效活性成分和标识物的一系列不同质量浓度的标准溶液进行高效液相色谱检测，得到3种药效活性成分和标识物分别对应的一系列不同质量浓度的液相色谱图，由所述3种药效活性成分和标识物分别对应的一系列不同质量浓度的液相色谱图得到3种药效活性和标识物的液相色谱保留时间和线性范围；

19、将一系列不同质量浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱检测，得到一系列不同质量浓度的混合标准溶液的液相色谱图，所述混合标准溶液包括3种药效活性成分、标识物和醇水溶剂，所述标识物包括木犀草素和/或豆甾醇；由所述一系列不同质量浓度的混合标准溶液中3种药效活性成分的质量浓度、所述混合标准溶液的液相色谱图和所述3种药效活性的液相色谱保留时间得到混合标准溶液中3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性拟合曲线；

20、由混合标准溶液中3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性拟合曲线得到混合标准溶液中3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性回归方程。

21、优选的，所述混合标准溶液中3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性回归方程包括：

22、所述槲皮素的质量浓度与峰面积的线性回归方程如式1所示：

23、y＝14689x+7 式1；

24、所述山奈酚的质量浓度与峰面积的线性回归方程如式2所示：

25、y＝10522x-5 式2；

26、所述β-谷甾醇的质量浓度与峰面积的线性回归方程如式3所示：

27、y＝14930x+2 式3；

28、式1～式3中：x分别表示混合标准溶液中槲皮素的质量浓度、山奈酚的质量浓度、β-谷甾醇的质量浓度；

29、式1～式3中：y分别表示混合标准溶液的液相色谱图中槲皮素的峰面积、山奈酚的峰面积、β-谷甾醇的峰面积。

30、优选的，所述高效液相色谱使用的色谱柱为zorbaxeclipseplus c18色谱柱；所述色谱柱的长度为150mm，内径为2.1mm，填充剂的尺寸为1.8μm。

31、本发明提供了一种普乐安片的检测方法，包括以下步骤：根据组成普乐安片的油菜花粉有效化学成分，采用网络药理学分析的方法获得普乐安片的复方中药网络药理图，根据所述普乐安片的复方中药网络药理图得到所述普乐安片的3种药效活性成分，所述3种药效活性成分分别为槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚；将普乐安片用极性溶剂进行提取，得到的提取液除溶剂后得到待测样品；将所述待测样品溶解于醇水溶剂中，得到待测样品溶液；将所述待测样品溶液进行高效液相色谱检测，得到待测样品溶液的液相色谱图，由所述待测样品溶液的液相色谱图得到所述普乐安片中3种药效活性成分对应的峰面积；再由3种药效活性成分的质量浓度与峰面积的线性拟合曲线或者线性回归方程得到所述普乐安片中3种药效活性成分的质量含量；所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为水，流动相b为乙腈；采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如上。本发明提供的检测方法采用网络药理学分析的方法准确测定了普乐安片的3种药效活性成分，并给出了普乐安片的药效活性成分含量的高效液相色谱的检测方法，通过控制高效液相色谱的检测条件，能够准确获得普乐安片的3种药效活性成分，从而能够作为普乐安片的质量控制指标。