一种家蚕造血器官损伤修复蛋白质及其应用

本发明属于生物，涉及一种家蚕造血器官损伤修复蛋白质，及利用该蛋白质促进造血器官释放血球的方法。

背景技术：

1、家蚕的血球在造血器官内形成，然后释放到循环血液中；血球及其关联蛋白质在组织器官的解离及对侵入体内的病原体与异物进行免疫防御反应中起很重要的作用。家蚕的造血器官功能破坏可引起幼虫血液中的游离血球数、血液蛋白质及免疫防御反应等幼虫的生物学特性的改变，从而影响幼虫的生长发育及生存。在前期的研究发现：家蚕造血器官损伤及其后的修复过程中会引起血液中的某些蛋白质(如bm eif2α等)发生改变，但这些基因或蛋白质参与调节家蚕造血器官发育及促进血球释放的研究及其报道不多。特别是在造血器官培养液中添加造血器官损伤修复相关的bm eif2α蛋白质，以促进造血器官释放血球增加血液中游离血球数的方法，目前尚没有。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种家蚕造血器官损伤修复相关bm eif2α蛋白质，及利用该蛋白质促进造血器官释放血球、增加血液中游离血球数的方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一、一种家蚕造血器官损伤修复蛋白质：

4、所述蛋白质的氨基酸序列为seq id no.1。

5、二、所述家蚕造血器官损伤修复蛋白质在家蚕造血器官损伤修复中的应用。

6、所述蛋白质促进造血器官释放血球进而对造血器官损伤修复。

7、三、一种所述家蚕造血器官损伤修复蛋白质的制备方法：

8、(1)家蚕造血器官损伤修复蛋白质基因的克隆：

9、以家蚕脂肪体的基因组为模板，利用pcr方法克隆获得家蚕bmeif2α基因；

10、(2)利用抗辐射菌构建含有家蚕bmeif2α基因的重组表达载体：

11、用限制性内切酶hindiii消化pcr方法克隆得到的产物pcr2.1-bmeif2α得到家蚕bmeif2α基因片段，然后克隆入pgroe-lux+2质粒获得重组体pgroe-lux+2-bmeif2α；

12、用构建的重组体pgroe-lux+2-bmeif2α导入转化抗辐射菌deinococcus grandis，得到具有表达家蚕造血器官损伤修复蛋白质基因的菌株；

13、(3)利用抗辐射菌的菌株在菌内表达家蚕造血器官损伤修复蛋白质。

14、所述步骤(1)具体是利用质量分数1％琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分析，并用pcr纯化试剂盒纯化，随后将家蚕bmeif2α基因的目的pcr产物pcr克隆进invitrogen公司的ta克隆载体pcr2.1，得到pcr克隆产物pcr2.1-bmeif2α，利用dna测序确认克隆的bmeif2α基因序列正确性。

15、所述步骤(1)中，pcr克隆的反应条件设置如下：

16、94℃，2min；94℃变性20sec，55℃退火40sec，72℃延伸55sec，共循环35个循环，72℃8min，lightcycler480操作系统(roche罗氏)。

17、pcr克隆的反应引物设置为：

18、正向引物：5′-gaagcttatgccgttgtcgtgtcgatttat-3′，如seq id no.2，下划线部分“aagctt”为hindiii酶切位点；

19、反向引物：5′-caagctttcaattgtcgtcttcttcgtccg-3′，如seq id no.3，下划线部分“aagctt”为hindiii酶切位点。

20、所述步骤(3)具体是：

21、将具有表达家蚕造血器官损伤修复蛋白质基因的菌株在tgy(tryptone glucoseyeast)培养基中30℃下培养6h后进行γ-射线辐照诱导，再继续培养，48h后收集细胞和上清液，以收集的细胞和上清液作为家蚕造血器官损伤修复蛋白质纯化的起始材料；

22、然后使用冻融法和超声波溶解收集的细胞和上清液，经高速离心后再次收集上清液；重组蛋白的n-末端带有6×his标签，再用ni-nta亲和柱在非变性条件下对再次收集的上清液进行蛋白纯化，获得家蚕造血器官损伤修复蛋白质。

23、所述的高速离心的速度为10000rpm左右。

24、所述的抗辐射菌deinococcus grandis是现有菌种，可以市购获得。

25、所述步骤(3)中，在再次收集上清液后，将所述上清液结合于ni-nta亲和柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有225mmol/l咪唑的非变性洗脱缓冲液进行洗脱，获得家蚕造血器官损伤修复蛋白质。

26、具体实施中，在获得家蚕造血器官损伤修复蛋白质后通过sds-page考马斯亮蓝染色后鉴定家蚕造血器官损伤修复蛋白质。

27、四、采用家蚕造血器官损伤修复蛋白质的造血器官损伤修复方法：

28、方法是在待处理的离体的造血器官培养液中添加10-20mg/l的上述家蚕造血器官损伤修复蛋白质，通过添加让造血器官培养液含有家蚕造血器官损伤修复蛋白质，使得家蚕造血器官损伤修复蛋白质进入到造血器官的细胞中，而促进造血器官释放血球增加血液中的游离血球数，从而实现对造血器官损伤修复。

29、本发明其原理是在造血器官的培养液中添加造血器官损伤修复相关的bm eif2α蛋白质，使培养液含有该蛋白质，该蛋白质进入细胞中促进造血器官释放血球、增加血液中游离血球数，为进一步研究家蚕血球的生理功能、提高血球相关的如消灭侵入体内的病原体或异物的能力提供可能。

30、本发明的有益效果在于：

31、本发明利用已构建的表达载体编码家蚕造血器官损伤修复蛋白质，通过添加的方法，让培养液含有造血器官损伤修复bmeif2α蛋白质，从而促进造血器官释放血球增加培养液中的游离血球数，为进一步研究家蚕血球的生理功能、提高血球相关的如及时包埋或消灭侵入体内的病原体或异物的能力提供可能，为增加蚕茧产质量、提高养蚕的经济效益创造条件，在蚕丝及制种业生产中具有重要的应用价值。

32、本发明通过大量实验证实，采用本发明方法得到的蛋白质添加在造血器官培养液中，可以增加血液中游离血球数8.3％-18.1％。

技术特征：

1.一种家蚕造血器官损伤修复蛋白质，其特征在于：

2.一种权利要求1所述家蚕造血器官损伤修复蛋白质的应用，其特征在于：

3.根据权利要求2所述家蚕造血器官损伤修复蛋白质的应用，其特征在于：

4.一种权利要求1所述家蚕造血器官损伤修复蛋白质的制备方法，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：

9.采用权利要求1所述家蚕造血器官损伤修复蛋白质、或者权利要求4-8任一所述制备方法制成的家蚕造血器官损伤修复蛋白质的造血器官损伤修复方法，其特征在于：

技术总结本发明公开了一种家蚕造血器官损伤修复蛋白质及其应用。克隆家蚕造血器官损伤修复蛋白质基因的，以家蚕脂肪体的基因组为模板，利用PCR方法克隆获得家蚕BmeIF2α基因；用限制性内切酶HindIII消化PCR方法克隆、并结合抗辐射菌构建含有家蚕BmeIF2α基因的重组表达载体，利用抗辐射菌的菌株在菌内表达家蚕造血器官损伤修复蛋白质，在造血器官培养液中添加上述家蚕造血器官损伤修复蛋白质促进造血器官释放血球增加血液中的游离血球数，从而实现对造血器官损伤修复。本发明能够促进造血器官释放血球增加培养液中的游离血球数，修复家蚕造血器官的损伤，用于增加蚕茧产质量、提高养蚕的经济效益，应用价值高。技术研发人员：屠振力受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18