仿生纳米颗粒对变异链球菌膜表面黏附因子的捕获方法

本发明涉及微生物资源获取，具体涉及一种仿生纳米颗粒对变异链球菌膜表面黏附因子的捕获方法。

背景技术：

1、变异链球菌是主要的致龋菌，它必须和牙面黏附后才能致龋，参与变异链球菌黏附性的物质基础是细菌的黏结素成分。黏结素是位于细菌表面参与细菌黏附的一组物质，其中主要成分是位于细菌表面的蛋白，这些蛋白主要包括:表面蛋白、葡糖基转移酶、葡萄糖结合蛋白和果糖基转移酶等。变异链球菌凭借这些黏结素介导与牙面的定植，是龋病发生发展的基础。研究还表明这些物质也参与到变异链球菌与其他致龋性细菌的共聚集中，形成生物膜使细菌层更加致密,细菌与牙面结合更加牢固,更加具有致龋性。而变异链球菌与益生菌的共聚集可以促进益生菌更好的发挥抗龋作用，同时形成的共聚体可加速致病菌的口内清除，对龋病防治发挥重要作用。因此对变异链球菌表面发挥与益生菌相黏附物质(黏附因子)的识别鉴定，成为阐释益生菌发挥益生效应的关键，同时也是促进高效、靶向防龋益生产品开发的基础。

2、在现有技术中，已有使用经典的化学试剂抽提+胶条鉴定来研究该类蛋白，但菌体蛋白高背景使得提取的黏附因子常常是不纯的蛋白粗混合物，且在提取过程会造成蛋白失活变性、浓度低、黏附因子获取率低等问题，使得黏附因子的研究受到较大阻碍。最重要的是，这些技术都只能实现对黏附因子的提取鉴定，并不能直接证明变异链球菌与益生菌之间的相互黏附作用。另外，理论上能够实现对变异链球菌与益生菌之间黏附因子进行识别的技术目前有“pull-down(下拉)”试验、“co-ip(免疫共沉淀)”试验，但这两项技术都需要预知益生菌表面发挥黏附作用的靶蛋白信息。当在无预知靶蛋白的情况下，对变异链球菌表面发挥与益生菌相黏附的蛋白进行捕获，现有技术并没有披露类似研究。

技术实现思路

1、本发明意在提供采用一种仿生纳米颗粒对变异链球菌膜表面黏附因子的捕获方法，以实现在无预知靶蛋白的情况下，对变异链球菌表面发挥与益生菌相黏附的蛋白进行捕获。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：仿生纳米颗粒对变异链球菌膜表面黏附因子的捕获方法，包括以下步骤：

3、步骤一：筛选能与变异链球菌共聚的益生菌，通过机械法去除益生菌膜内物质，分离得到益生菌外膜；

4、步骤二：将益生菌外膜与plga-nps溶液进行混合，并采用超声处理10min混合均匀；使用脂质体挤出器将混合溶液通过200nm滤膜挤出，得到直径200±20nm的仿生纳米颗粒；

5、步骤三：获取变异链球菌外膜，将外膜进行裂解得到变异链球菌膜表面蛋白组分溶液；

6、步骤四：将步骤二中的仿生纳米颗粒溶液与步骤三中的变异链球菌膜表面蛋白组分溶液等量混合，并通过混合仪混合，进行超4小时的孵育；

7、步骤五：将步骤四进行孵育的混合液取出，离心分离上清液及沉淀组分；

8、步骤六：取沉淀组分在pbs缓冲液中洗涤2-3次，然后将其沉淀进行裂解，即可得到黏附因子。

9、本方案的原理和优点：

10、本方案运用仿生纳米技术对特定蛋白进行捕获，然后对捕获的蛋白进行定量分析。实现在无预知靶蛋白的情况下，对变异链球菌表面发挥与益生菌相黏附的蛋白进行捕获；接着确定黏附因子的蛋白质信息，根据蛋白质信息确定黏附因子特性；进一步依据黏附因子特性制造出利于牙齿健康的益生菌产品，提高防龋益生产品的疗效。

11、具体是将能与变异链球菌共聚的益生菌外膜内填充plga纳米颗粒的结构，形成一种仿生纳米颗粒。plga纳米颗粒内衬在益生菌外膜内，使得益生菌外膜被撑开，外膜上能够与变异链球菌膜表面黏附因子结合的特殊位点完全暴露出来。然后采用膜蛋白裂解工艺，将变异链球菌(s.m)的细胞膜蛋白组分全部析出，其中包含能与益生菌外膜相结合的黏附因子。最后通过仿生纳米颗粒与变异链球菌(s.m)的细胞膜表面蛋白组分进行混合孵育，让变异链球菌(s.m)的细胞膜表面蛋白组分与益生菌的外膜充分接触，使得变异链球菌(s.m)的膜表面蛋白中的黏附因子结合在益生菌的外膜上，经过后续的分离，达到变异链球菌(s.m)的黏附因子的捕获。

12、通过本方案能够有效避免传统蛋白组学研究中变异链球菌全蛋白的高背景问题，即避免了因为细菌全蛋白种类繁多、且胞质蛋白量占优势，造成对相对低丰度的胞膜蛋白掩盖问题。无须预知靶蛋白便可实现对黏附因子的捕获；纳米技术使得该蛋白捕获方法具有高通量性、亲和富集性，增强结果的可信度，不仅可用于表征已知的蛋白，还可以发现及鉴定新的效应蛋白。

13、优选的，步骤一中，能与变异链球菌共聚的益生菌为嗜酸乳杆菌。

14、进一步，通过如下方法获取嗜酸乳杆菌外膜，具体包括：

15、s11、液体培养基中培养24h的嗜酸乳杆菌4000rmp离心15min，弃上清液，收集菌体沉淀，并进行洗涤，得到嗜酸乳杆菌悬液；

16、s12、嗜酸乳杆菌悬液中加入适量研磨珠，利用冷冻研磨仪机械破坏细菌结构；

17、s13、继续用超声细胞破碎仪进行超声；

18、s14、超声后的细菌悬液及研磨珠的混合物通过差速离心法分离，先于4℃、4000rpm条件下离心10min；

19、s15、弃去包括研磨珠、细胞、细胞碎片的沉淀，收集上清液；将其置于4℃、14000rpm条件下离心40min；

20、s16、收集步骤s15的沉淀得到嗜酸乳杆菌外膜。

21、该改进的有益效果是：通过上述步骤，能够较完全得到嗜酸乳杆菌外膜物质。

22、优选的，在步骤s16中，收集到嗜酸乳杆菌外膜还需采用无菌水洗涤膜沉淀物，并通过400nm的多孔聚碳酸酯膜挤出，以获得纯化的嗜酸乳杆菌细胞膜。

23、优选的，在步骤二中，通过如下方法获取plga-nps溶液，具体包括：

24、s21、将30mgplga粉末溶于5ml丙酮中；

25、s22、在1000r/min磁力搅拌下逐滴加入到10ml双蒸水中，并常温搅拌4h，得到液体即为plga-nps溶液，在4℃下保存plga-nps溶液，使用前通过0.45umpvdf滤器过滤。

26、plga粉末为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，在生物医学上用于药物递送的载体。

27、优选的，步骤三中，通过如下方法获取变异链球菌膜表面蛋白组分，具体包括：

28、s31、取变异链球菌培养液，冰浴20分钟；

29、s32、取出变异链球菌培养液，4℃、4000rpm离心10min，分离出变异链球菌体沉淀；

30、s33、将变异链球菌体置于洗涤缓冲液中2次及以上，取出洗涤后的沉淀物；

31、s34、使用与s33相同的缓冲液重新将沉淀物进行悬浮形成变异链球菌悬浮液；

32、s35、将变异链球菌悬浮液在4℃、离心力为16000xg、离心10min，取上清液，并去除代表完整细胞和细胞碎片的沉淀部分；

33、s36、取s35步骤中的上清液，在4℃、离心力为100000xg、离心18h后静置，获得变异链球菌膜碎片的沉淀；

34、s37、将s36中的异链球菌膜碎片的沉淀进行裂解，裂解后取上清液得到变异链球菌膜表面蛋白组分溶液。

35、优选的，s33步骤中采用的洗涤缓冲液为丝氨酸蛋白酶抑制剂(pmsf)，丝氨酸蛋白酶抑制剂与s33步骤中的变异链球菌细胞比例为200：1。

36、该改进的有益效果是：通过丝氨酸蛋白酶抑制剂(pmsf)：tm缓冲液＝100:1作为洗涤缓冲液能够较好的保护膜表面蛋白不受酶降解。

37、tm缓冲液为50mm的tris-maleate(马来酸),与ph为6.0,20mm的mgcl2的混合液。

38、优选的，在步骤s34～s36之间还包括冷冻研磨步骤，在变异链球菌悬浮液中加入玻璃珠，并在-50℃条件下冷冻研磨20min，放入离心力为3000xg的离心机中离心5min去除玻璃珠。

39、该改进的有益效果是：通过玻璃珠在冷冻条件下研磨，可以以物理手段实现变异链球菌细胞膜的裂解，避免采用破坏蛋白活性的化学物质。

40、优选的，在步骤六中；静置之后，沉淀组分在缓冲液中洗涤2-3次后，进行裂解成肽段之后进行质谱定量检测。

41、优选的，步骤六中得到的黏附因子，均于-80℃冰箱中保存。通过低温保存，避免黏附因子失活，造成捕获不能。