一种CD344+人胎盘间充质干细胞的制备及其应用的制作方法

本发明属于细胞生物，具体涉及一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备及其应用。

背景技术：

1、肺纤维化(pulmonary fibrosis,pf)，也称为弥漫性肺实质性疾病，是由各种不同原因引起的累及肺间质、肺泡、细支气管的肺部弥漫性疾病，严重危害人类的健康，其病因复杂，临床治疗效果差。特发性肺间质纤维化和非特异性间质性肺炎是最为常见的两种类型，尤其是特发性肺间质纤维化对目前包括糖皮质激素和细胞毒性药物在内的治疗几乎无反应，预后差，平均5年生存率仅为30～50％。肺纤维化多在40～50岁发病，男性多发于女性。呼吸困难是肺纤维化最常见症状。轻度肺纤维化时，呼吸困难常在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。其他症状有干咳、乏力，部分患者有杵状指和发绀。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。当大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液，患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。

2、间充质干细胞(mscs)是一类具有自我更新和分化潜力的干细胞，被广泛研究用于各种疾病的治疗。mscs通过旁分泌和细胞-细胞接触方式能够调节免疫反应、减少炎症反应，并促进组织修复和再生，这些特性使得mscs成为一种有前景的肺纤维化治疗方式，可作为肺纤维化的替代药物治疗手段。然而，mscs在改善肺纤维化症状方面仍然面临着许多挑战，一方面植入的细胞存活率通常较低；另一方面是复杂的病理微环境带来的不确定性，这也是需要进一步研究和优化的方向。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备及其应用。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备，包括如下步骤：

4、(1)将人胎盘胎儿侧0.5cm厚的组织切成1mm3大小，经pbs冲洗，利用100u/ml的胶原酶a和10μg/ml的dnase i在37℃下消化组织2h，收集上清，用100μm细胞筛过滤，去除残留组织块；

5、(2)将分离的细胞在540g下离心10min，培养于含1×glutamaxtm和50μg/ml庆大霉素的nuwacell ncmission hmscmedium，置于37℃、5％co2及饱和湿度培养箱培养；

6、(3)约至80％融合度，利用trypletmexpress消化并收集单个细胞继续传代培养；

7、(4)经trypletmexpress消化并重悬hfpmscs于pbs溶液，制备成5×106个/ml的细胞悬液，分别向100μl加入荧光基团标记的不同抗体及相应同型对照抗体，4℃避光孵育30min，加入500μl预冷pbs，1000rpm离心弃上清；

8、(5)将细胞沉淀重悬于400μl pbs，利用流式细胞仪检测细胞各表面标志物的表达情况；

9、(6)经trypletmexpress消化并重悬hfpmscs于pbs溶液，制备成5×106个/ml的细胞悬液，向100μl细胞悬液中加入荧光基团标记的cd344抗体及相应同型对照抗体，4℃避光孵育30min，加入500μl预冷pbs，1000rpm离心弃上清；

10、(7)将细胞沉淀重悬于400μl pbs，利用流式细胞仪检测细胞cd344的表达情况并分选出cd344+人胎盘间充质干细胞并通过流式细胞术进行验证。

11、进一步地，步骤(3)中选择3～5代细胞进行实验。

12、进一步地，步骤(4)中所述的抗体为：fitc-cd14、fitc-cd34、pe-cd45、pe-cd73、pe-cd90、pe-cd105、fitc-hla-dr。

13、进一步地，步骤(7)中所述的通过活细胞荧光激活细胞分选术进行cd344+人胎盘间充质干细胞的分选。

14、一种cd344+人胎盘间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用。

15、cd344(frizzled-4)是wnt蛋白的受体，与经典的β-连环蛋白途径相关。

16、本发明相比现有技术具有以下优点：

17、本申请研究发现，表达cd344的人胎盘间充质干细胞能够显著增加间充质干细胞的活性和增殖能力，并提高其对肺纤维化的治疗效果。本申请成功制备了cd344+人胎盘间充质干细胞，并进行了增值检测，结果显示cd344+亚群细胞具有更强的增殖能力，另外进行了cd344+人胎盘间充质干细胞治疗肺纤维化的疗效评估果显示cd344+亚群细胞具有更好的抗纤维化效果。本申请的研究成果在肺纤维化治疗中将有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备，其特征在于，步骤(3)中选择3～5代细胞进行实验。

3.根据权利要求1所述一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备，其特征在于，步骤(4)中所述的抗体为：fitc-cd14、fitc-cd34、pe-cd45、pe-cd73、pe-cd90、pe-cd105、fitc-hla-dr。

4.根据权利要求1所述一种cd344+人胎盘间充质干细胞的制备，其特征在于，步骤(7)中所述的通过活细胞荧光激活细胞分选术进行cd344+人胎盘间充质干细胞的分选。

5.权利要求1～4任一项所述的cd344+人胎盘间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用。

技术总结本发明公开了一种CD344+人胎盘间充质干细胞的制备及其应用，属于细胞生物技术领域，本申请研究发现，表达CD344的人胎盘间充质干细胞能够显著增加间充质干细胞的活性和增殖能力，并提高其对肺纤维化的治疗效果。本申请成功制备了CD344+人胎盘间充质干细胞，并进行了增值检测，结果显示CD344+亚群细胞具有更强的增殖能力，另外进行了CD344+人胎盘间充质干细胞治疗肺纤维化的疗效评估果显示CD344+亚群细胞具有更好的抗纤维化效果。本申请的研究成果在肺纤维化治疗中将有广阔的应用前景。技术研发人员：朱永朝,韩笑受保护的技术使用者：中启源（宁夏）生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18