一种特异性检测间型球孢囊霉的靶标Rpb1基因及其应用

本发明属于生物技术检测领域，涉及一种特异性检测间型球孢囊霉的靶标rpb1基因及其应用。

背景技术：

1、间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)是一种重要的植物病原菌，属于卵菌门(oomycota)，是广义腐霉类群，能侵染多针叶树、花卉和农作物，如绣球、玫瑰、欧芹、欧洲萝卜和大豆等，世界广布，引起植株根腐、猝倒等多种症状，等在受侵染植物生产中造成较重的经济损失。globisporangiumintermedium菌丝无隔，老后有隔，不规则分枝，孢子囊球形或近球形，链生，菌丝生长的最低、最适和最高温度分别为0℃、25-28℃和35℃。globisporangiumintermedium形态上极易与长孢囊霉菌，狭义腐霉菌，疫腐霉菌和密孢囊菌中的种混淆，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验区分。并且球孢囊霉菌具有很高的形态多样性，有些物种之间的形态特征又具有交叉性，还有些物种存在较高的种内形态变异，而且有些表型容易受环境条件和营养基质的影响而出现较大的变化，往往难以通过肉眼观察来判断这些复杂多变的形态特征之间的相互联系。

2、目前，针对globisporangiumintermedium的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法，依据globisporangiumintermedium的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且由于globisporangiumintermedium是异宗配合物种，自然条件下不产生卵孢子，很难依据形态学特征将globisporangium intermedium与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。普通pcr技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于基层推广。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究。lamp技术作为一种恒温核酸扩增技术，其最大的优点在于反应速度快、设备简单，而且结果易于鉴定，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前国内外尚未见利用lamp技术检测globisporangiumintermedium的相关报道。

4、为了防控globisporangiumintermedium的传播，需要对其进行快速准确地检测。发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。

5、综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对提升对globisporangiumintermedium的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种特异性检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的靶标rna聚合酶ii大亚基序列(rpb1)基因。本发明的第二目的是提供了一种以rpb1基因为特异性靶标检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的lamp引物组合物及其应用。本发明的第三目的是提供了一种检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的lamp方法。

2、技术方案：本发明的特异性检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的靶标rpb1基因，所述靶标rpb1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的以rpb1基因为特异性靶标检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的lamp引物组合物，所述引物组合物包括：如seq id no.2所示的正向内引物fip，如seq id no.3所示的反向内引物bip，如seq id no.4所示的正向外引物f3，如seq id no.5所示的反向外引物b3，如seq id no.6所示的反向环引物lb。

4、本发明根据globisporangiumintermedium的rpb1基因序列，该序列在globisporangiumintermedium中的基因组进化区和保守区轮流间隔。利用blast软件将globisporangiumintermedium的基因组序列与其它真菌的基因组序列进行比较，选取了globisporangiumintermedium特有的一端序列并设计特异性的lamp引物。lamp反应通过4条引物(fip、bip、f3、b3)特异性识别靶序列上的6个独立区域(表1)，其特异性比较高。此外，反向环引物lb能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行globisporangiumintermedium检测。lamp反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

5、本发明的以上述rpb1基因为特异性靶标检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的lamp引物组合物在制备试剂盒中的应用。

6、本发明的用于检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的lamp试剂盒，所述试剂盒中包含上述的lamp引物组合物。

7、进一步地，所述试剂盒还包含10×thermopol buffer、mgso4、dntps、甜菜碱、bstdna polymerase、羟基萘酚蓝。

8、一种上述lamp引物组合物、lamp试剂盒在检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)中的应用，所述的检测为非疾病诊断目的的检测。

9、本发明的检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的lamp方法，包括以下步骤：提取待检微生物dna，取dna溶液作为反应模板，以上述的引物组合物进行lamp反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若扩增产物呈天蓝色表示检测结果为阳性，则表示待检测生物中存在间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)；若扩增产物呈紫色表示检测结果为阴性，则表示待检测生物中不存在间型球孢囊霉(globisporangium intermedium)。

10、进一步地，所述lamp反应体系为：2.5μl 10×thermopol buffer，8mmol·l-1mgso4，1.2mmol·l-1dntps，内引物fip和bip各1.6μmol·l-1，外引物f3和b3各0.4μmol·l-1，0.8μmol·l-1环引物lb，0.8μmol·l-1甜菜碱，8u·μl-1bst dna polymerase，180mmol·l-1羟基萘酚蓝，2μl模板dna，灭菌水补至26μl。

11、进一步地，所述lamp反应的程序为：63℃反应扩增63min。

12、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明公开的特异性检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)的靶标rpb1基因，基于该靶标基因设计的lamp引物组合物可用于快速高效检测间型球孢囊霉(globisporangiumintermedium)，检测方法具有特异性强、准确度高、灵敏度好、操作简单、可肉眼观察结果的优点，当dna达到10pg·μl-1时即可鉴定出间型球孢囊霉，实用性强。