多重特异性结合剂及其用途的制作方法

本公开一般地涉及具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标，如pd-l1的一个或多个其他结合结构域的多重特异性结合剂，如双重特异性抗体以及它们的使用方法。

背景技术：

1、肿瘤细胞已显示使用先天和适应性检查点来逃避抗肿瘤免疫应答。cd47和pd-l1是两种在肿瘤细胞的细胞表面上广泛表达的靶标，它们分别可以协同抑制先天和适应性传感以逃避免疫控制。

2、cd47是细胞表面糖蛋白，其起到天然免疫系统细胞介导的吞噬的调节剂的作用。cd47与多种配体相互作用，如整合素、信号调节蛋白α(sirpα)、信号调节蛋白γ(sirpγ)和血小板反应蛋白。cd47通过与巨噬细胞和树突状细胞表面上的sirpα相互作用抑制吞噬，从而引发“不要吃我”的信号。

3、表达cd47能够使肿瘤细胞逃避吞噬和逃脱先天免疫监视。因此，cd47已成为可能的治疗剂的靶标。然而，cd47在正常细胞，如造血细胞、红细胞(rbc)和血小板上广泛表达。健康细胞对cd47的广泛表达提供了安全性和效力问题，因为用中和抗体靶向cd47可以影响健康细胞，从而可能导致毒性作用。另外，cd47的广泛表达还可以导致cd47结合剂快速消除，从而导致不良的药物动力学和降低的效力。

4、另外，cd47的激活或失去可以以细胞类型依赖性方式导致增殖增强。例如，星形细胞瘤细胞已显示在cd47和tsp-1激活后具有提高的增殖，尽管正常星形胶质细胞没有。目前还提出cd47可以通过pi3k/akt通路辅助癌细胞增殖。

5、已知一旦抑制cd47结合至sirpα，已报道的多种抗cd47抗体引起rbc凝集，这显著降低了这些抗体的治疗效果。

6、程序死亡配体1(pd-l1)是特异性结合至作为关键免疫检查点受体的程序死亡受体1(pd-1)的细胞表面糖蛋白配体。通过激活的t细胞、b细胞和单核细胞上调pd-1并且pd-1介导免疫抑制。而另一个pd-1配体，pd-l2主要在激活的抗原-递呈细胞(apc)上表达，pd-l1广泛表达，包括在造血系细胞，如激活的t细胞、b细胞、单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞以及在外周组织，如心脏、骨胳、肌肉、胎盘、肺、肾和肝脏组织中。

7、pd-l1与pd-1的结合是可以激活t细胞中的pd-1受体的下游信号传导的阴性检查点，因此抑制t细胞的增殖、细胞因子产生和释放和细胞毒性。t细胞激活和效应因子细胞因子分泌的这种抑制可以防止自体免疫和慢性感染。

8、然而，多种肿瘤细胞使用这种机制来保护它们避免免疫攻击，从而导致肿瘤免疫逃避。多种癌症过表达pd-l1，并且其过表达通常与不良预后相关。在癌症中，pd-1/pd-l1相互作用刺激下游信号来抑制t细胞激活，从而导致肿瘤细胞存活。

9、已将pd-1与其配体的相互作用的阻断剂建议作为增强t细胞对肿瘤细胞的免疫应答的免疫治疗方法。当前pd-1/pd-l1基免疫疗法的策略已在治疗一些晚期癌瘤中显示出效力，但是对多种实体瘤和某些pd-l1功能具有有限影响。因此，本领域仍急需可以抑制或防止pd-1/pd-l1相互作用的剂。

10、因此，本领域仍需克服这些问题并且靶向cd47及其他靶标，如pd-l1来治疗、预防或减轻免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况，包括涉及表达cd47和/或pd-l1的肿瘤细胞的那些的剂。本文所提供的多重特异性结合剂、组合物和方法满足这种需要并且提供了相关优势。

技术实现思路

1、本公开提供了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域，和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域。这些剂包括结合至cd47和一个或多个其他不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域的多重特异性抗体。在一些实施方案中，这些剂包括结合至cd47和一个或多个其他不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的多重特异性抗体(例如，双重特异性抗体)，例如，具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域的多重特异性抗体，其中第一结合结构域包含：重链可变(vh)区，其包含表1中所示的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3氨基酸序列；和轻链可变(vl)区，其包含表1中所示的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3氨基酸序列，或其中多重特异性抗体与具有本文(例如，表1)所述的重链可变区和轻链可变区的抗体竞争对人cd47的结合。

2、本公开还提供了编码本文提供的多重特异性结合剂(例如，抗体或其片段)的核酸、包含这些核酸中的一种或多种的载体和表达所述核酸的细胞。

3、本公开还提供了包含本文所述的多重特异性结合剂的组合物。在一些实施方案中，这些组合物包含结合至cd47和一个或多个其他不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域的多重特异性抗体。在一些实施方案中，这些组合物包含结合至cd47和一个或多个其他不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域的多重特异性抗体，其中第一结合结构域包含：重链可变(vh)区，其包含表1中所示的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3氨基酸序列；和轻链可变(vl)区，其包含表1中所示的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3氨基酸序列，或其中多重特异性抗体与具有本文(例如，表1)所述的重链可变区和轻链可变区的抗体竞争对人cd47的结合。

4、本公开还提供了用如本文所述的多重特异性结合剂或包含所述多重特异性结合剂，包括双重特异性抗体的组合物或包含所述双重特异性抗体的组合物治疗、预防或减轻免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况(例如，吞噬细胞功能障碍疾病、病症或病况或t细胞功能障碍疾病、病症或病况)，包括免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况的一种或多种症状的方法。这些组合物包含结合至cd47和一个或多个其他不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域的多重特异性抗体。在一些实施方案中，这些组合物包含结合至cd47和一个或多个其他不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至cd47，包括人cd47的第一结合结构域和结合至一个或多个不是cd47的靶标(例如，pd-l1)的一个或多个其他结合结构域并且与具有本文(例如，表1)所述的重链可变区和轻链可变区的抗体竞争对人cd47的结合的多重特异性抗体。

5、附图文字

6、图1a至1e显示了实施例2中进一步描述的细胞结合测定的示例性结果。图1a显示了bsab1与pd-l1表达mda-mb-231细胞(本文称为pdl1-mda-mb-231细胞)的结合。图1b显示了bsab1与nci-h292的结合。图1c显示了bsab1与ht-1080的结合。图1d显示了bsab1缺少与rbc的结合。图1e显示了bsab1与有或没有rbc的nci-h292的结合。

7、图2a和2b显示了实施例3中进一步描述的cd47/sirpα抑制测定的两种示例性结果。

8、图3a和3b显示了实施例3中进一步描述的pd-l1/pd-1抑制测定的两种示例性结果。

9、图4a至4d显示了实施例4中进一步描述的吞噬测定的示例性结果。

10、图5a至5d显示了实施例5中进一步描述的红细胞凝集测定的示例性结果。

11、图6显示了实施例6中进一步描述的sec色谱法的示例性结果。

12、图7显示了实施例6中进一步描述的hic色谱法的示例性结果。

13、图8显示了实施例6中进一步描述的smac色谱法的示例性结果。

14、图9a至9b显示了实施例7中进一步描述的体内效力研究的示例性结果。

15、图10a至10c显示了实施例8中进一步描述的非人灵长类动物(nhp)中测试的示例性结果。

16、图11显示了实施例1中进一步描述的bsab1结合至人pd-l1的示例性biacore传感图。