利用ADAR编辑用于感知响应应用的活细胞中的RNA传感器

背景技术：

1、单细胞转录组学通常是定义细胞类型和状态的实际方法，但根据rna谱靶向细胞仍然具有挑战性。例如，rna感知响应系统能够(例如在癌症和自身免疫性疾病的背景下)识别和破坏有害细胞，或在复杂环境(例如神经系统和免疫系统)中对特定细胞进行实验性操作。可用的rna传感技术仅限于mirna，或者需要围绕功能性rna结构(如核酶、向导rna或内部核糖体进入位点)进行精心设计。对于后者，另一个混杂因素是细胞对双链rna(dsrna)的天然响应。作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)对dsrna进行编辑可以编辑特定的rna。

2、本文提供了利用adar编辑检测靶rna和在靶细胞中表达蛋白质的方法和试剂盒。

技术实现思路

1、本公开提供了一种用于在靶细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括将靶细胞与包含以下项的传感器rna组合：(ia)包含与靶rna反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包含含有一个或多个可编辑密码子的茎环(stem-loop)序列，或(ib)包含与靶rna的3’utr反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包含一个或多个可编辑密码子，以及(ii)编码第一切割结构域的第二核苷酸序列，以及(iii)编码输出蛋白的第三核苷酸序列；其中靶rna存在于靶细胞中。

2、本公开提供了一种用于检测靶rna的方法，该方法包括(a)将所述生物样品与包含以下项的传感器rna组合：(i)编码标记蛋白的第一核苷酸序列，(ii)包括与靶rna的3'utr反向互补的传感器核苷酸序列的第二核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包括终止密码子，(iii)编码第二切割结构域的第三核苷酸序列，以及(iv)编码输出蛋白的第四核苷酸序列；(b)测定生物样品中输出蛋白的存在。

3、本公开还提供了一种用于检测生物样品中的靶rna的方法，该方法包括：(a)将所述生物样品与包含以下项的传感器rna组合：(i)包含含有一个或多个终止密码子的茎环序列的第一核苷酸序列，(ii)包括与靶rna反向互补的传感器核苷酸序列的第二核苷酸序列，(iii)编码第一切割结构域的第三核苷酸序列，以及(iv)编码输出蛋白的第四核苷酸序列；以及(b)测定生物样品中输出蛋白的存在。

4、本公开提供了一种用于检测生物样品中的靶rna的方法，该方法包括：(a)将所述生物样品与包含以下项的传感器rna组合：(i)包含与靶rna反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包含起始密码子，以及(ii)编码输出蛋白的第二核苷酸序列；以及(b)测定生物样品中输出蛋白的存在。

5、本公开提供了一种用于检测生物样品中的靶rna的方法，该方法包括：(a)将所述生物样品与包含以下项的传感器rna组合：(i)包含与靶rna反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包含aua序列，以及(ii)编码输出蛋白的第二核苷酸序列；以及(b)测定生物样品中输出蛋白的存在。

6、还提供了用于实践主题方法的试剂盒。

技术特征：

1.一种用于在靶细胞中表达蛋白质的方法，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述包含与靶rna反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中所述传感器核苷酸序列包含含有一个或多个可编辑密码子的茎环序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述包含与靶rna的3’utr反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中所述传感器核苷酸序列包含一个或多个可编辑密码子。

4.如权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述可编辑密码子是终止密码子、起始密码子或aua密码子。

5.如权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中(ia)中的所述可编辑密码子包含与所述一个或多个可编辑密码子相对的所述茎环内的序列错配的至少1个碱基，并且/或者(ib)中的所述可编辑密码子包含与所述靶rna的所述3’utr错配的至少1个碱基。

6.如权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述切割结构域是2a自切割结构域，其选自t2a、p2a、e2a和f2a。

7.如权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述输出蛋白选自荧光蛋白、基因组修饰蛋白、转录因子、杀伤因子、毒素、抗原、t细胞受体、嵌合抗原受体、治疗性蛋白和酶。

8.如权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述靶rna与疾病、病况、细胞类型或组织相关联。

9.如权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述靶rna由基因融合体、剪接变体或包含单核苷酸多态性或多核苷酸变体的基因变体编码。

10.如权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述输出蛋白治疗所述疾病或病况。

11.如权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中(ia)中的所述茎环是glur-b茎环或其修饰变体。

12.如权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中所述传感器核苷酸序列与单个靶rna内的两个或更多个不连续序列反向互补。

13.如权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述与靶细胞组合包括使所述靶细胞与包含所述传感器rna的脂质纳米颗粒接触。

14.如权利要求1-13所述的方法，其中所述与靶细胞组合包括使所述靶细胞与包含所述传感器rna的腺相关病毒(aav)接触，其中所述传感器rna包含在aav载体中。

15.如权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中所述传感器rna进一步包含编码与第二靶rna反向互补的第二传感器核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述第一靶rna和所述第二靶rna的序列不同。

16.如权利要求1-15中的任一项所述的方法，其进一步包括：

17.如权利要求1-16中的任一项所述的方法，其进一步包括将所述靶细胞与作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)蛋白或其编码序列组合，其中所述adar蛋白选自adar2、adarp110、adarp150、包含adar脱氨酶结构域和rna基序结合结构域的修饰adar。

18.如权利要求1-17中的任一项所述的方法，其进一步包括测定所述输出蛋白的存在，其中所述测定包括使用显微术、流式细胞术、免疫印迹或其组合。

19.如权利要求1-18中的任一项所述的方法，其中组合包括向患者施用所述传感器rna。

技术总结一种用于在靶细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括将靶细胞与包含以下项的传感器RNA组合：(ia)包含与靶RNA反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包含含有一个或多个可编辑密码子的茎环序列，和/或(ib)包含与靶RNA的3’UTR反向互补的传感器核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中传感器核苷酸序列包含一个或多个可编辑密码子，以及(ii)编码第一切割结构域的第二核苷酸序列，以及(iii)编码输出蛋白的第三核苷酸序列；其中靶RNA存在于靶细胞中。技术研发人员：高小井,克里斯蒂安·埃里克·卡塞尼特,诺亚·卡兹,纳塔尔·S·科尔伯,埃里克·沃尔夫斯堡受保护的技术使用者：小利兰·斯坦福大学托管委员会技术研发日：技术公布日：2024/11/18