一种基于牛磺酸相关性分析的肠道微生物检测方法与流程

本发明涉及一种基于血液中牛磺酸相关性分析的肠道微生物检测方法，主要通过与血液中牛磺酸含量建立相关性关系，对体内肠道微生物的相对丰度进行估算，属于生物检测术领域。

背景技术：

1、肠道是人体非常重要的消化系统，肠道中含有大量的微生物，使肠道具有原来不具有的功能。这些微生物和宿主之间存在着复杂的相互作用，可以影响宿主的健康状况和抵抗力。有研究表明，人体肠道中细菌含量约占人体细菌总含量的78％。因此人体的肠道细菌是一个不可忽视的存在。正常健康的肠道菌群可以提高人体抵抗力，此外还有抗衰老、免疫、排毒、抗肿瘤的作用。人体很多常见的慢性疾病如肥胖症，炎症性肠病、抑郁症等都与肠道微生物密切相关，因此对肠道微生物状态进行检测与监控可以有效预防相关疾病。

2、目前肠道微生物的检测与监控多是通过对人体粪便样本进行16s dna测序进行，需要采样者、检测者和被检测者承受巨大的心理压力。同时这种采样方法还具有粪便取样困难，取样时机难以把握，样本质量差等问题。

3、牛磺酸又称为β-氨基乙磺酸，是一种含硫的非蛋白氨基酸，也是机体不可缺少的一种生物活性物质。牛磺酸能够作用于人体的神经系统、消化系统、循环系统、生殖系统、运动系统，具有消炎抗菌、抗病毒、镇静、镇痛的作用。有研究表明，牛磺酸还与某些疾病的发生有关，如牛磺酸是心脏中较为丰富的游离氨基酸，抑制血小板凝聚，可以缓解高血压、高血糖、高血脂、动脉硬化、心肌梗死等疾病，能够保护心脏，缓解心律失常。

4、肠道菌群和牛磺酸相互影响。一方面，人体内的牛磺酸代谢与生成受多种肠道微生物的影响，特定类型的细菌参与了牛磺酸的代谢过程，促进了牛磺酸在人体内的生成和利用。人体内牛磺酸的代谢与生成与一些肠道细菌有关，如绿饰菌属、芽孢杆菌属，这些细菌可以参与牛磺酸代谢过程，促进牛磺酸的生成。另一方面，牛磺酸也能够影响肠道细菌。牛磺酸的前体是胆汁酸，胆汁酸在肠道中有抗菌作用，能够抑制有害菌生长，促进益生菌生长，调节肠道生态平衡。

5、肠道中的细菌是肠道微生态的重要影响因素，这些细菌在整个肠道中相互影响，相互制约。这些细菌间的相互关系主要有包括互利共生、共栖、寄生、捕食、偏害共栖和竞争等类型，相互作用会对参与者产生正向、负向和中性三种影响。各种影响相互交织，形成复杂的共发生网络。因此在肠道微生态中，占比比较大的细菌会促进其正向作用的细菌生长，抑制其负向作用细菌的生长。

6、相关性分析是指对两个或多个具备相关性的变量元素进行分析，从而衡量两个变量因素的相关密切程度。相关性的元素之间需要存在一定的联系或者概率才可以进行相关性分析。目前牛磺酸和肠道微生物只是单独检测，成本较高，很少有研究者将两者结合。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于血液中牛磺酸相关性分析的肠道微生物检测方法。目的在于减少诊断成本，为不方便提供粪便样本做肠道微生物检测的人群提供另一种检测方法。本发明通过将相互影响的牛磺酸和肠道微生物进行相关性分析，计算相关性系数，同时将相关性强的牛磺酸与肠道微生物丰度拟合得出拟合公式，将相关性强的肠道微生物相对丰度进行拟合分析，得出拟合公式，可以快速较准确的通过血液中牛磺酸含量确定与牛磺酸相关的肠道微生物状态，再由该肠道微生物状态得出其余肠道常见微生物状态，对肠道微生物有一个整体全面的判断。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种基于血液中牛磺酸相关性分析的肠道微生物检测方法，包括步骤如下：

4、s1：构建牛磺酸标准曲线；

5、s2：根据s1构建的牛磺酸标准曲线，采用lc-ms/ms法测定并计算血液样品中的牛磺酸含量；

6、s3：根据s2测定的血液样品中的牛磺酸含量，采用拟合公式计算第一批肠道微生物的相对丰度；

7、s4：根据s3所得第一批肠道微生物的相对丰度，采用拟合公式计算第二批肠道微生物的相对丰度。

8、根据本发明优选的，s1中，所述牛磺酸标准曲线为：y＝6998.71121x+6.21442e5；

9、其中，y为峰面积，x为牛磺酸浓度(μg/l)。

10、根据本发明优选的，s3中，所述肠道微生物为绿饰菌属、芽孢杆菌属。

11、根据本发明优选的，s3中，所述拟合公式具体如下：

12、牛磺酸与芽孢杆菌属的拟合公式为：y＝0.00072x+0.00101；

13、牛磺酸与绿饰菌属的拟合公式为：y＝0.00202x+0.000012；

14、其中，y为第一批肠道微生物在属水平上的相对丰度，x为血液中牛磺酸含量(mg/l)。

15、根据本发明优选的，s4中，所述第二批肠道微生物为肠杆菌属、普氏菌属。

16、根据本发明优选的，s4中，所述拟合公式具体如下：

17、普氏菌属与芽孢杆菌属拟合公式为：y＝0.02176x+0.00001；

18、肠杆菌属与绿饰菌属拟合公式为：y＝1.89962x+0.00003；

19、其中，y为第二批肠道微生物在属水平上的相对丰度，x为第一批肠道微生物在属水平上的相对丰度。

20、根据本发明，一种优选的技术方案，所述基于血液中牛磺酸相关性分析的肠道微生物检测方法具体步骤如下：

21、(1)精准称量牛磺酸标准品0.001mg于10ml容量瓶中，使用50％的乙腈溶液将其溶解，制成浓度为1mg/l的牛磺酸标准液；

22、(2)向2ml空白血浆加入步骤(1)制备的牛磺酸标准液，得到梯度浓度的牛磺酸标准品溶液；所述梯度浓度为500μg/l、250μg/l、150μg/l、100μg/l、50μg/l、20μg/l、10μg/l、5μg/l、2.5μg/l、1μg/l、0.5μg/l、0.25μg/l、0.1μg/l；

23、(3)将步骤(2)所得梯度浓度的牛磺酸标准品溶液涡旋混匀30s，4℃，12000r/min，高速离心5min后，取上清液，作为样本；

24、(4)将步骤(3)所得上清液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，以为样本浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，构建牛磺酸标准曲线；

25、所述高效液相色谱的条件如下：

26、色谱柱：zorbax sb-c18(150mm×21mm，5μm)；柱温:30℃；流动相：(a)甲醇(b)10mmol/l醋酸铵溶液(甲酸调ph至3.0)；流速0.25ml/min；进样量10μl；

27、梯度洗脱程序：

28、

29、所述串联质谱的质谱源参数如下：喷雾电压：-40kv；毛细管加热温度：370℃；鞘气(氮气)压力：41arb(1arb＝6894.76pa)；辅助气(氮气)压力：25arb；碰撞气压力(氩气)：1.5mtorr(1mtorr＝0.13pa)；扫描时间：0.5s；

30、所述牛磺酸标准曲线为：y＝6998.71121x+6.21442e5；

31、其中，y为峰面积，x为牛磺酸含量(μg/l)；

32、(5)采集待测人员血液，按照步骤(3)处理后注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，根据步骤(4)构建的牛磺酸标准曲线计算血液样品中牛磺酸的含量；

33、(6)根据步骤(5)测定的牛磺酸的含量，采用拟合公式计算第一批肠道微生物的相对丰度；

34、所述拟合公式具体如下：

35、牛磺酸与芽孢杆菌属的拟合公式为：y＝0.00072x+0.00101；

36、牛磺酸与绿饰菌属的拟合公式为：y＝0.00202x+0.000012；

37、其中，y为第一批肠道微生物在属水平上的相对丰度，x为血液中牛磺酸含量(mg/l)；

38、(7)根据步骤(6)中计算得到的第一批肠道微生物相对丰度，采用拟合公式计算其他第二批肠道微生物的相对丰度；

39、所述拟合公式具体如下：

40、普氏菌属与芽孢杆菌属拟合公式为：y＝0.02176x+0.00001；

41、肠杆菌属与绿饰菌属拟合公式为：y＝1.89962x+0.00003；

42、其中，y为第二批肠道微生物在属水平上的相对丰度，x为第一批肠道微生物在属水平上的相对丰度。

43、本发明的有益效果在于：

44、本发明根据1000例儿童肠道微生物的二代高通量测序结果和血液中牛磺酸含量的质谱学检测结果进行了血液中牛磺酸含量与肠道微生物的相关性分析，得出了血液中牛磺酸含量与肠道微生物的相关性拟合公式和肠道微生物之间的拟合公式，然后通过肠道微生物与牛磺酸之间的拟合公式，根据血液中牛磺酸的含量计算肠道中芽孢杆菌属、绿饰菌属的丰度。同时又依据上述肠道微生物的相对丰度，参照肠道微生物之间的拟合公式，对肠道内部其他微生物相对丰度进行了计算。

45、本发明提供的基于血液中牛磺酸相关性分析的肠道微生物检测方法简便快速，无需粪便取样，仅仅通过采取血液样本，就可以实现血液中牛磺酸和肠道中微生物相对丰度的检测，解决了检测肠道微生物时采样困难，检测困难的问题，节约了时间成本和经济成本，同时不仅可以得到与牛磺酸相关的肠道微生物丰度，还可以得到其他在肠道中具有重要作用的微生物，对肠道微生物状态进行了较全面的检测。可以广泛应用于需要快速检测牛磺酸和肠道微生物的各种情境中，有效克服了现有技术中存在的粪便取样困难，取样时机难以把握，样本质量差等问题。