一种针孔阵列盘、调焦转盘及三维转盘共聚焦显微镜的制作方法

本发明属于显微镜，尤其涉及一种针孔阵列盘、调焦转盘及三维转盘共聚焦显微镜。

背景技术：

1、荧光是指一种光致发光现象，特定波长的光照射到荧光分子上，电子由原来能量较低的能级跃迁到能量较高的能级。由于激发态的不稳定性，电子会回到基态同时能量会以光的形式释放(辐射)从而产生荧光。荧光显微成像的基本原理是：将荧光分子作为探针对生物组织的某种生物大分子进行特异性标记,通过探测受激荧光分子发射的荧光信号,从而获取样品的空间位置信息。但荧光显微镜照亮整个样品并检测所产生荧光，进而采集包含焦平面上方和下方的离焦光，从而导致模糊和图像质量下降。当对三维样本(例如含有会散射光的液体填充区域的细胞)进行成像时，这种效应会加剧，从而导致信息丢失。

2、共聚焦显微镜采用针孔来抑制离焦光从而获得更高的分辨率和层切能力。样本焦平面与针孔处于共聚焦位置，针孔只获取来自样品焦平面的荧光，离焦信号被消除，成像更加清晰，提高了分辨率、对比度并降低了背景信号；但是针孔只能对样品的一小部分区域进行成像，因此需要扫描整个样品，这需要时间并可能导致光损伤影响细胞活性。

3、转盘共聚焦显微镜是共聚焦显微镜的一种，不是单个针孔，而是在高速旋转的不透明圆盘上呈螺旋状排列的针孔阵列。旋转时，针孔成行扫描样品，形成图像。由于采用并行采集的方式，使用转盘可以大幅提高图像采集速度，并减少光损伤。其中包含一种双转盘共聚焦显微镜，实现对焦平面的快速成像。但是现有技术中，针孔阵列中针孔的数量过多的话，一方面难以保证阵列的质量，也会增加成本，另一方面还要保证扫描视野的明亮和扫描速度，不利于实际中的大范围使用。

4、在实际实施过程中，对复杂曲面观测通常需要三维成像，其中包含以下几种实现方式：第一种采用不同焦距物镜方式，例如，专利公开号为cn219370113u的专利文献，公布了一种共聚焦显微镜。通过不同物镜控制焦距使激光在样品z轴方向扫描，观测不同信息，缺点是替换物镜速度缓慢，并且在更换过程中会进一步造成光损伤从而影响细胞活性。第二种采用移动物镜方式，例如，专利公开号为cn111638596a的专利文献，公开了一种共聚焦显微镜，通过电动三轴转台驱动物镜，对焦单元完成对焦，实现焦平面上下移动，成像不同层的信息，此方法较第一种方案提升了成像速度，但仍不足。第三种光场显微成像，例如，专利公开号为cn109615651a的专利文献，公开了一种基于光场显微系统的三维显微成像方法及系统装置，由于光场显微技术中，采集光场图像时将不同角度的信息集成到同一张图像下，光场成像有效数值孔径被牺牲，导致分辨率较差。

5、因此，急需研发一种显微镜来解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于满足实际需求，提供一种针孔阵列盘、调焦转盘及三维转盘共聚焦显微镜，可以在减少圆孔数量的情况下采集到所有区域的图像信息，使得扫描视野更加明亮，提高成像分辨率；降低加工成本，提高了针孔阵列盘的品质。

2、第一方面，为实现上述发明目的，本发明的第一目的是提供一种针孔阵列盘，包括：1.不透光材质制成的环形盘，所述环形盘的外径为a，内径为b；在所述环形盘上开设有m个用于照明和激发荧光分子通过的圆孔；其中：

3、m个圆孔分布在外径为c，内径为d的环形开孔区域；c不大于a，b不大于d；

4、m个圆孔分为n组；m为大于0的自然数，n的取值范围是10-30；

5、每组圆孔分布在l条阿基米德螺线上，所述阿基米德螺线的起始点为d，截止点为c。

6、进一步地，所述l的计算公式为：

7、

8、其中，d为圆孔孔径，s为阿基米德螺线上相邻圆孔之间的孔距，n为正整数。

9、进一步地，d为20mm，c为25mm。

10、进一步地，d为50um，s为250um。

11、进一步地，各组内相邻阿基米德螺线上的首个圆孔偏移s/l um的距离。

12、第二方面，本发明的第二目的是提供一种调焦转盘，包括：

13、第一方面所述的针孔阵列盘；位于针孔阵列盘上方的透镜阵列盘；位于针孔阵列盘下方的调焦盘；所述针孔阵列盘、透镜阵列盘和调焦盘为同轴关系。

14、进一步地，所述透镜阵列盘对应针孔阵列盘上圆孔的位置处设有微透镜。

15、进一步地，所述调焦盘包括k组调焦玻璃组，所述调焦玻璃组包括s块圆弧形的玻璃；其中，k和s是不为0的自然数。

16、进一步地，所述针孔阵列盘、透镜阵列盘和调焦盘集成在一起。

17、第三方面，本发明的第三目的是提供一种三维转盘共聚焦显微镜，包括：用于产生激发样品荧光物质的激发光源；用于分离射入样品的激发光与从样品中受激发产生的荧光的二向色镜组件；用于将经过二向色镜组件出来的激发光聚焦到样品面上的透镜组件；用于将荧光组成图像的成像模块；设置在二向色镜组件和成像模块之间的透镜系统，还包括：

18、第二方面所述的调焦转盘，用于对激发光束进行光学滤波并且进行对焦平面的偏移；

19、信号同步模块，用于确定成像模块采集周期与调焦转盘之间运动周期的时序关系；其中，所述二向色镜组件位于调焦转盘的针孔阵列盘和透镜阵列盘之间。

20、本申请具有的优点和积极效果是：

21、1、本申请设计了一种针孔阵列盘，将阿基米德螺线针孔阵列分组设置，并将各组内的螺线均进行偏移，可以在减少圆孔数量的情况下采集到所有区域的图像信息，偏移的设置补偿了孔距，使得扫描视野更加明亮，提高成像分辨率；圆孔数量的减少降低了加工成本，提高了针孔阵列盘的品质；

22、2、本申请提供了一种针孔阵列盘、透镜阵列和调焦盘结合使用的调焦转盘，三者同轴设置，进行同步转动，可以实现聚焦激发光，实现快速变焦的目的；

23、3、本申请还提供了一种三维转盘共聚焦显微镜，通过调焦转盘实现调焦的目的，且设置了信号同步模块，以同步成像模块采集周期和调焦转盘之间的运动周期的时序关系；通过针孔阵列盘实现快速成像、通过采用调焦盘实现可变焦，解决了转盘共聚焦三维成像受到移动样品速度慢的限制。

技术特征：

1.一种针孔阵列盘，其特征在于，包括：不透光材质制成的环形盘，所述环形盘的外径为a，内径为b；在所述环形盘上开设有m个用于照明和激发荧光分子通过的圆孔；其中：

2.根据权利要求1所述的针孔阵列盘，其特征在于，所述l的计算公式为：

3.根据权利要求1所述的针孔阵列盘，其特征在于，d为20mm，c为25mm。

4.根据权利要求2所述的针孔阵列盘，其特征在于，d为50um，s为250um。

5.根据权利要求1所述的针孔阵列盘，其特征在于，各组内相邻阿基米德螺线上的首个圆孔偏移s/l um的距离。

6.一种调焦转盘，其特征在于，包括：

7.根据权利要求所6述的调焦转盘，其特征在于，所述透镜阵列盘(2)对应针孔阵列盘(1)圆孔的位置处设有微透镜。

8.根据权利要求6所述的调焦转盘，其特征在于，所述调焦盘(3)包括k组调焦玻璃组(31)，所述调焦玻璃组(31)包括s块圆弧形的玻璃；其中，k和s是不为0的自然数。

9.根据权利要求6所述的调焦转盘，其特征在于，所述针孔阵列盘(1)、透镜阵列盘(2)和调焦盘(3)集成在一起。

10.一种三维转盘共聚焦显微镜，包括：用于产生激发样品荧光物质的激发光源；用于分离射入样品的激发光与从样品中受激发产生的荧光的二向色镜组件；用于将经过二向色镜组件出来的激发光聚焦到样品面上的透镜组件；用于将荧光组成图像的成像模块；设置在二向色镜组件(5)和成像模块(7)之间的透镜系统(8)，其特征在于，还包括：

技术总结本发明公开了一种针孔阵列盘、调焦转盘及三维转盘共聚焦显微镜，属于显微镜技术领域；包括：不透光材质制成的环形盘，所述环形盘的外径为a，内径为b；在所述环形盘上开设有M个用于照明和激发荧光分子通过的圆孔；其中：M个圆孔分布在外径为c，内径为d的环形开孔区域；c不大于a，b不大于d；M个圆孔分为N组；M为大于0的自然数，N的取值范围是10‑30；每组圆孔分布在L条阿基米德螺线上，所述阿基米德螺线的起始点为d，截止点为c。本发明的优点是：可以在减少圆孔数量的情况下采集到所有区域的图像信息，使得扫描视野更加明亮，提高成像分辨率；圆孔数量的减少降低了加工成本，提高了针孔阵列盘的品质。技术研发人员：杨旭三,王豪,谢浩,钱皓受保护的技术使用者：长三角物理研究中心有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2