一种土茯苓HPLC指纹图谱的建立及抗氧化活性谱效分析方法与流程

本发明属于中药分析领域，具体涉及一种土茯苓hplc指纹图谱的建立及抗氧化活性谱效分析方法。

背景技术：

1、土茯苓为百合科植物光叶菝葜smilax glabra roxb.的干燥根茎，味甘、淡,性平，归肝、胃经，别称刺猪苓、过山龙、仙余粮等。多生长于山坡、荒山及林边的半阴地，资源丰富，广泛分布于我国湖南、云南、广西等地。具有解毒除湿，通利关节的功效，用于湿热淋浊，带下，痈肿，瘰疬，疥癣，梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛等证。土茯苓的主要成分有黄酮类、苯丙素类、甾体类、有机酸类、挥发油类等，现代药理研究表明土茯苓具有抗氧化、免疫抑制、抗炎、保护心血管系统、抗肿瘤、抑菌等作用。

2、指纹图谱结合化学模式识别已广泛用于中药的质量控制，可从整体上更客观地反映中药的质量，是评价药材质量的重要手段。中药谱效分析是将化学指纹图谱信息与药效评价相结合，探索“谱”与“效”之间的相互规律，明确有效成分的组成和活性贡献程度。目前，已有关于土茯苓中多糖、总黄酮、土茯苓叶和种子的抗氧化活性研究，但尚未见对土茯苓的谱效关系研究报道，土茯苓中发挥抗氧化作用的具体贡献成分尚不明确。因此，本发明通过建立土茯苓的hplc指纹图谱，并测定其体外抗氧化活性，首次以指纹图谱及抗氧化活性为切入点，结合多个谱效分析方法筛选土茯苓的抗氧化活性成分群，为完善土茯苓药材的质量评价体系和开发利用提供参考依据。

技术实现思路

1、本发明提供一种土茯苓药材的hplc指纹图谱，其特征在于当hplc色谱条件如下时，所述土茯苓药材的hplc指纹图谱基本与图1一致；

2、hplc色谱条件如下：

3、色谱柱为agilent 5tc-c18，规格：250mm×4.6mm，5μm；

4、流动相：乙腈为a相，0.05wt％的磷酸水溶液为b相；

5、梯度洗脱：0～16min，a相体积百分比为6％→14％；16～28min，a相体积百分比为14％→16％，28～32min，a相体积百分比为16％，32～42min，a相体积百分比为16％→18％；42～48min，a相体积百分比为18％，48～56min，a相体积百分比为18％～23％，56～62min，a相体积百分比为23％，62～70min，a相体积百分比为23％～30％，70～80min，a相体积百分比为30％；流速：0.8ml·min-1；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量10μl。

6、本发明的另一实施方案提供上述土茯苓药材的hplc指纹图谱，其特征在于所述土茯苓药材的hplc指纹图谱基本与图1一致，具有不少于19个特征指纹色谱峰，其中2号峰为儿茶素，6号峰为表儿茶素，8号峰为5-o-咖啡酰莽草酸，12号峰为新落新妇苷，13号峰为落新妇苷，15号峰为新异落新妇苷，16号峰为异落新妇苷，17号峰为黄杞苷，18号峰为白藜芦醇。

7、本发明的另一实施方案提供上述土茯苓药材的hplc指纹图谱，其特征在于以8号峰的保留时间作为参比，土茯苓药材的hplc指纹图谱中2号、6号、12号、13号、15号、16号、17号、18号峰的相对保留时间如下表所示：

8、

9、本发明的另一实施方案提供上述土茯苓药材的hplc指纹图谱在土茯苓药材质量控制、成分分析中的应用。

10、本发明的另一实施方案提供上述土茯苓药材的hplc指纹图谱在土茯苓药材质量控制中的应用，其特征在于所述应用包括如下步骤：

11、(1)将土茯苓药材粉碎后超声提取，配置成供试品溶液；

12、(2)取步骤(1)得到的供试品溶液，经hplc检测，得供试品的hplc图，其中色谱条件如下：

13、色谱柱为agilent 5tc-c18，规格：250mm×4.6mm，5μm；

14、流动相：乙腈为a相，0.05wt％的磷酸水溶液为b相；

15、梯度洗脱：0～16min，a相体积百分比为6％→14％；16～28min，a相体积百分比为14％→16％，28～32min，a相体积百分比为16％，32～42min，a相体积百分比为16％→18％；42～48min，a相体积百分比为18％，48～56min，a相体积百分比为18％～23％，56～62min，a相体积百分比为23％，62～70min，a相体积百分比为23％～30％，70～80min，a相体积百分比为30％；流速：0.8ml·min-1；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量10μl；

16、(3)将步骤(2)得到的供试品的hplc色谱图与本发明所述的土茯苓药材的hplc指纹图谱比较，相似度在0.81以上的土茯苓药材为合格产品。相似度在0.95以上的土茯苓药材为优质产品。

17、其中步骤(1)所述的供试品溶液的制备方法如下：将土茯苓药材粉碎，过40目筛，称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30min，静置放冷至室温，再称定重量，用体积分数70％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

18、本发明所述土茯苓药材指土茯苓饮片。

19、与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明通过不同产地土茯苓药材样品hplc分析，建立土茯苓药材指纹图谱，为土茯苓药材的质量控制提供了有效方法；(2)通过分析40批不同产地土茯苓药材的hplc图谱，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行分析，确定了土茯苓药材的hplc指纹图谱共有模式，标定了19个共有峰，其中2号峰为儿茶素，6号峰为表儿茶素，8号峰为5-o-咖啡酰莽草酸，12号峰为新落新妇苷，13号峰为落新妇苷，15号峰为新异落新妇苷，16号峰为异落新妇苷，17号峰为黄杞苷，18号峰为白藜芦醇；(3)通过聚类分析(hca)和主成分分析(pca)初步对土茯苓样品进行综合评价，通过不同测试方法评估了样品的抗氧化活性，并通过灰色关联分析(gra)和偏最小二乘回归(plsr)分析建立了土茯苓的谱效关系，发现表儿茶素、新异落新妇苷、异落新妇苷等成分与抗氧化活性指标关联度高，可能是土茯苓抗氧化作用的关键性成分。

技术特征：

1.一种土茯苓药材的hplc指纹图谱，其特征在于当hplc色谱条件如下时，所述土茯苓药材的hplc指纹图谱基本与图1一致；

2.权利要求1所述的土茯苓药材的hplc指纹图谱，其特征在于所述土茯苓药材的hplc指纹图谱基本与图1一致，具有不少于19个特征指纹色谱峰，其中2号峰为儿茶素，6号峰为表儿茶素，8号峰为5-o-咖啡酰莽草酸，12号峰为新落新妇苷，13号峰为落新妇苷，15号峰为新异落新妇苷，16号峰为异落新妇苷，17号峰为黄杞苷，18号峰为白藜芦醇。

3.权利要求1-2任一项所述的土茯苓药材的hplc指纹图谱，其特征在于以8号峰的保留时间作为参比，土茯苓药材的hplc指纹图谱中2号、6号、12号、13号、15号、16号、17号、18号峰的相对保留时间如下表所示：

4.权利要求1-3任一项所述的土茯苓药材的hplc指纹图谱在土茯苓药材质量控制、成分分析中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的土茯苓药材的hplc指纹图谱在土茯苓药材质量控制中的应用，其特征在于所述应用包括如下步骤：

6.权利要求5所述的应用，其特征在于步骤(1)所述的供试品溶液的制备方法如下：将土茯苓药材粉碎，过40目筛，称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30min，静置放冷至室温，再称定重量，用体积分数70％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

技术总结本发明属于中药分析领域，具体涉及一种土茯苓HPLC指纹图谱的建立及抗氧化活性谱效分析方法。本发明建立了40批不同来源土茯苓样品的HPLC指纹图谱，并识别了19个共有峰。通过聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)初步对土茯苓样品进行综合评价，通过不同测试方法评估了样品的抗氧化活性，并通过灰色关联分析(GRA)和偏最小二乘回归(PLSR)分析建立了土茯苓的谱效关系，发现表儿茶素、新异落新妇苷、异落新妇苷等成分与抗氧化活性指标关联度高，可能是土茯苓抗氧化作用的关键性成分。本发明为土茯苓药效物质基础研究及质量控制提供了科学有效的方法，也为土茯苓的开发利用提供参考。技术研发人员：张玉茹,孟雪,张红,陈娟,王娣,张瑜受保护的技术使用者：陕西省中医药研究院技术研发日：技术公布日：2024/12/2