多聚ADP核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法、ELISA试剂盒及其应用与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种多聚adp核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法、elisa试剂盒及其应用。

背景技术：

1、adp核糖基化修饰（adp-ribosylation）是生物体内一种重要的翻译后修饰，在dna损伤修复的快速应答中发挥重要作用，以nad+为底物，由多聚adp核糖聚合酶（parps）催化发生，在相应蛋白上形成adp核糖修饰；多聚adp核糖聚合酶1（parp1）通过介导par链合成在dna损伤修复中发挥重要调控作用。多聚adp核糖聚合酶1因其在dna损伤修复中的重要作用成为抗肿瘤药物研究的重要靶点。因此一种便于实施的高通量筛选多聚adp核糖聚合酶1抑制剂的检测方法对于该靶点新药研发具有重要作用。

2、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种多聚adp核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法，以解决上述技术问题。

2、本发明的第二目的在于提供一种elisa试剂盒。

3、本发明的第三目的在于提供上述elisa试剂盒在多聚adp核糖聚合酶1抑制剂筛选中的应用。

4、为了实现上述目的，提出以下技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种多聚adp核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法，采用elisa的方法进行筛选，包括以下步骤：

6、在酶标板上包被组蛋白h3，然后添加多聚adp核糖聚合酶1和待测药物进行第一次孵育，之后添加nad+进行第二次孵育；第二次孵育结束后去除反应液，添加特异性识别多聚adp核糖基化修饰的一抗进行第三次孵育；第三次孵育结束后去除反应液，添加特异性识别所述一抗且带有辣根过氧化物酶标记的二抗进行第四次孵育；第四次孵育结束后去除反应液，添加tmb显色液进行显色反应，根据显色结果计算待测药物对于多聚adp核糖聚合酶1的抑制率。

7、作为进一步技术方案，在酶标板上包被组蛋白h3的步骤包括：用包被缓冲液将组蛋白h3稀释至10-100nm，然后取10-15μl添加在酶标板的酶标孔内，于2-8℃包被10-24h，之后依次经过清洗和封闭液封闭后，完成组蛋白h3在酶标板上的包被；

8、优选地，所述包被缓冲液包括：ph9.6的50mm碳酸盐缓冲液；

9、优选地，所述封闭液为含有1wt%-3wt% bsa的pbst溶液。

10、作为进一步技术方案，通过添加多聚adp核糖聚合酶1溶液和待测药物溶液进行第一次孵育；

11、所述多聚adp核糖聚合酶1溶液为含有多聚adp核糖聚合酶1的缓冲液，缓冲液组成为100mm tris、100mm nacl、10mm mgcl2、100nm dna、1mm dtt，ph8.0；

12、所述多聚adp核糖聚合酶1溶液中多聚adp核糖聚合酶1的浓度为1-1000nm，多聚adp核糖聚合酶1溶液的加入量为10-15μl；

13、所述待测药物溶液包括溶有待测药物的dmso溶液；

14、所述第一次孵育的温度为24-28℃，孵育的时间为10-15min。

15、作为进一步技术方案，通过添加nad+溶液进行第二次孵育；nad+溶液组成为100mmtris ph8.0、100mm nacl、10mm mgcl2、100nm dna、1mm dtt、20-200μm nad+；

16、nad+溶液的加入量为10-15μl；

17、所述第二次孵育的温度为20-30℃，孵育的时间为30-60min。

18、作为进一步技术方案，通过添加所述一抗的溶液进行第三次孵育；

19、所述一抗的溶液为含有一抗的bsa水溶液，其中，bsa的浓度为1-3wt%；

20、所述一抗的溶液的添加量为50-100μl；

21、所述第三次孵育的温度为2-6℃，时间为12-20h。

22、作为进一步技术方案，添加所述二抗的溶液进行第四次孵育；

23、所述二抗的溶液为含有二抗的pbst溶液；

24、所述二抗的溶液的添加量为50-100μl；

25、所述第四次孵育的温度为25-37℃，时间为30-60min。

26、作为进一步技术方案，所述显色反应结束后添加终止液进行终止反应，然后用酶标仪测定酶标板在波长为450nm时的吸光值。

27、作为进一步技术方案，所述抑制率的计算公式如下：

28、抑制率=（信号max-信号x）/（信号max-信号min）×100%；

29、其中，信号max：表示多聚adp核糖聚合酶1活性未被抑制时的od450nm读值；信号min：表示多聚adp核糖聚合酶1完全没有活性时的od450nm读值，信号x：表示添加多聚adp核糖聚合酶1抑制剂时的od450nm读值。

30、第二方面，本发明提供了一种elisa试剂盒，包括酶标板、组蛋白h3、洗涤液、封闭液、多聚adp核糖聚合酶1、nad+、特异性识别多聚adp核糖基化修饰的一抗、特异性识别所述一抗且带有辣根过氧化物酶标记的二抗、tmb显色液和终止液。

31、第三方面，本发明提供了上述elisa试剂盒在多聚adp核糖聚合酶1抑制剂筛选中的应用。

32、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

33、本发明提供的多聚adp核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法，具有快速、微量、高效、易实施且经济的特点，能够实现对以多聚adp核糖聚合酶1为靶点的待测药物的高通量筛选，对于该靶点的新药研发具有重要作用。

技术特征：

1.一种多聚adp核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法，其特征在于，采用elisa的方法进行筛选，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，在酶标板上包被组蛋白h3的步骤包括：用包被缓冲液将组蛋白h3稀释至10-100nm，然后取10-15μl添加在酶标板的酶标孔内，于2-8℃包被10-24h，之后依次经过清洗和封闭液封闭后，完成组蛋白h3在酶标板上的包被；

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，通过添加多聚adp核糖聚合酶1溶液和待测药物溶液进行第一次孵育；

4. 根据权利要求1所述的筛 选方法，其特征在于，通过添加nad+溶液进行第二次孵育；nad+溶液组成为100mm tris ph8.0、100mm nacl、10mm mgcl2、100nm dna、1mm dtt、20-200μm nad+；

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，通过添加所述一抗的溶液进行第三次孵育；

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，添加所述二抗的溶液进行第四次孵育；

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述显色反应结束后添加终止液进行终止反应，然后用酶标仪测定酶标板在波长为450nm时的吸光值。

8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述抑制率的计算公式如下：

9.一种elisa试剂盒，其特征在于，包括酶标板、组蛋白h3、洗涤液、封闭液、多聚adp核糖聚合酶1、nad+、特异性识别多聚adp核糖基化修饰的一抗、特异性识别所述一抗且带有辣根过氧化物酶标记的二抗、tmb显色液和终止液。

10.权利要求9所述的elisa试剂盒在多聚adp核糖聚合酶1抑制剂筛选中的应用。

技术总结本发明提供了一种多聚ADP核糖聚合酶1抑制剂的筛选方法、ELISA试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供的筛选方法，包括：在酶标板上包被组蛋白H3，然后添加多聚ADP核糖聚合酶1和待测药物进行第一次孵育，之后添加NAD+进行第二次孵育；第二次孵育结束后去除反应液，添加特异性识别多聚ADP核糖基化修饰的一抗进行第三次孵育；第三次孵育结束后去除反应液，添加特异性识别所述一抗且带有辣根过氧化物酶标记的二抗进行第四次孵育；第四次孵育结束后去除反应液，添加TMB显色液进行显色反应，根据显色结果计算待测药物对于多聚ADP核糖聚合酶1的抑制率。该筛选方法易实施、高效、通量高。技术研发人员：崔亚琦,施松,谢月,贺虎受保护的技术使用者：杭州圣域生物医药科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2