用于同时检测多种细菌的标志物、TaqMan引物探针组、LAMP引物组、试剂盒、检测方法、重组质粒及应用与流程

本申请涉及细菌检测，具体涉及用于同时检测多种细菌的标志物、taqman引物探针组、lamp引物组、试剂盒、检测方法、重组质粒及应用。

背景技术：

1、在食品、药品、医疗器械等领域，生产环境中细菌等微生物超标是造成产品污染的重要原因。在细胞治疗领域，产品往往无法进行终端灭菌或除菌过滤，对工艺的无菌保障和过程控制要求更高，如目前研发/上市最多的自体型car-t细胞治疗产品，存在个体差异大、单批产量少、部分产品有效期短、临床需求紧迫，急需快速放行，传统的无菌检查方法，需要耗时至少两周，这成为制约放行时间的最大短板之一，因此，在细菌质控上需要采用更加快速灵活的方法。

2、利用基因检测手段可以提高细菌检测的速度和灵敏性，但目前市场上的基于基因检测的细菌检测技术主要是针对细菌种类进行单一检测。生产车间或实验室环境中微生态环境比较复杂，造成细菌污染的菌种繁多，其中，蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌种均是生产环境中的常见菌，如果对多个细菌品种逐一进行检测和验证，导致整个检测方法复杂，耗费时间久，造成检测成本高等问题。

3、因此，开发快速、同时检测多种细菌的检测产品和方法成为市场所需。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请的目的在于提供用于同时检测多种细菌的标志物、taqman引物探针组、lamp引物组、试剂盒、检测方法、重组质粒及应用。该标志物为一段16s rrna基因的片段，可用于同时检测蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌6种细菌。针对该标志物序列，分别设计了taqman引物探针组、环介导等温扩增(lamp)引物组，并进行核酸扩增实验，最终的实验结果表明该标志物序列和taqman引物探针组、lamp引物组可以用于至少6种细菌的检测，具备检测准确性好、灵敏性高、检测速度快等优势。

2、为达到或至少部分达到上述目的，本申请提供了如下技术方案：

3、第一方面，本申请提供了一种用于检测多种细菌的基因标志物，用于同时检测包括蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌至少6种细菌，所述基因标志物选自下列中的至少一种：

4、(1)seq id no:1所示的核苷酸序列；

5、(2)来源于蜡样芽孢杆菌中16s rrna基因且与seq id no:1具有95％以上同源性的核苷酸序列。

6、第二方面，本申请提供了一种taqman引物探针组，所述taqman引物探针组用于特异性扩增前述基因标志物中的至少一种，所述taqman引物探针组包括核苷酸序列如seq idno:2、seq id no:4所示的引物和如seq id no:4所示的探针。

7、第三方面，本申请提供了一种lamp引物组，所述lamp引物组用于特异性扩增前述基因标志物中的至少一种，所述lamp引物组包括下列引物：

8、f3：核苷酸序列如seq id no:5所示；

9、b3：核苷酸序列如seq id no:6所示；

10、fip：核苷酸序列如seq id no:7所示；

11、bip：核苷酸序列如seq id no:8所示；

12、lf：核苷酸序列如seq id no:9所示；

13、lb：核苷酸序列如seq id no:10所示。

14、第四方面，本申请提供了一种试剂盒，其包括前述taqman引物探针组和/或lamp引物组。

15、第五方面，本申请提供了一种同时检测包括蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌至少6种细菌的方法，所述方法为taqmanpcr，采用了前述taqman引物探针组。

16、第六方面，本申请提供了另一种同时检测包括蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌至少6种细菌的方法，所述方法为lamp，采用了前述lamp引物组。

17、第七方面，本申请还提供了一种重组质粒，所述重组质粒的目的基因片段为前述基因标志物的核苷酸序列。

18、第八方面，本申请提供了前述基因标志物在制备多细菌检测产品中的应用。

19、本申请提供的用于同时检测多种细菌的标志物、taqman引物探针组、lamp引物组、试剂盒、检测方法、重组质粒及应用。与现有技术相比，至少具备以下有益效果：

20、1.本申请提供的用于检测的基因标志物、taqman引物探针组、lamp引物组的特异性强、灵敏性高，有利于提高检测准确性，且检测方法简单、耗时短、检测成本低。taqman引物探针组、lamp引物组分别用细菌检测的方法具有良好的兼并性效果。

21、2.本申请提供的试剂盒产品，能够同时针对蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等6种细菌进行检测，具有灵敏度好、准确性高、线性可报告范围广的优点。

技术特征：

1.一种用于检测多种细菌的基因标志物，其特征在于，所述基因标志物用于同时检测至少包括蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌6种以上细菌，所述基因标志物选自下列中的至少一种：

2.一种taqman引物探针组，其特征在于，所述taqman引物探针组用于特异性扩增权利要求1所述基因标志物中的至少一种，所述taqman引物探针组包括核苷酸序列如seq idno:2、seq id no:3所示的引物和如seq id no:4所示的探针。

3.一种lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组用于特异性扩增权利要求1基因标志物中的至少一种，所述lamp引物组包括下列引物：

4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述taqman引物探针组和/或权利要求3所述lamp引物组。

5.一种同时检测蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌6种细菌的方法，其特征在于，所述方法为taqman pcr，采用了权利要求2所述taqman引物探针组。

6.一种同时检测蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌6种细菌的方法，其特征在于，所述方法为lamp，采用了权利要求3所述lamp引物组。

7.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的目的基因片段为权利要求1所述基因标志物的核苷酸序列。

8.权利要求1所述基因标志物在制备多细菌检测产品中的应用。

技术总结本申请公开了用于同时检测6种细菌的标志物、TaqMan引物探针组、LAMP引物组、试剂盒、检测方法、重组质粒及应用。该标志物为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或来源于蜡样芽孢杆菌中16S rRNA基因且与SEQ ID NO:1具有95％以上同源性的核苷酸序列。本申请提供了一种TaqMan引物探针组和一种LAMP引物组，通过该TaqMan引物探针组和该LAMP引物组结合相应的TaqMan PCR或LAMP法均可以同时实现对蜡样芽孢杆菌、玫瑰考克氏菌、微球菌、嗜根考克氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌6种细菌的快速检测。最终的检测结果证明，本申请提供的检测方法在检测6种细菌时具备高灵敏性和准确性。技术研发人员：刘滨磊,汪洋,杨靖如,周芹受保护的技术使用者：武汉滨会生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/12