用于检测基因变异的核酸产品、试剂盒及装置和应用的制作方法

本技术涉及生物，具体涉及用于检测基因变异的核酸产品、试剂盒及装置和应用。

背景技术：

1、单基因遗传病是指由某种特定基因的突变引起的疾病。这些基因突变可以遗传给后代，导致患上相同的疾病或症状。常见的单基因遗传病包括脊髓性肌萎缩症、多种皮肤病、色素失禁症以及多囊肾等。

2、其中，脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是一种单基因变异所致的常染色体隐性遗传病，是婴儿期最常见的致死性遗传病，发病率约为1/10000，人群携带率约为1/50；若夫妇双方均为sma携带者，后代患病的概率为1/4。sma的致病基因smn1(omim600354)和修饰基因smn2(omim 601627)高度同源，仅5个碱基的差异。smn1决定疾病的发生，其中约95％是由smn1拷贝数变异导致，5％由smn1复合杂合突变所致-目前国内外已报道的微小致病性变异约90种(http://www.hgmd.cf.ac.uk)，中国患者已报道近30种；smn2影响疾病的严重程度和进展，使得sma的遗传学诊断不同于绝大多数单基因遗传病。

3、丝聚蛋白(filaggrin，flg)基因位于染色体1q21.3区，在表皮、口腔及鼻黏膜等膜组织中表达，主要编码丝聚蛋白原。丝聚蛋白原是高度磷酸化且不溶于水的蛋白质，在表皮分化时经过去磷酸化和水解作用形成可溶性的flg单体，单体与角蛋白等成分紧密结合成细胞被膜的蛋白骨架，作为牢固的表皮屏障，阻止外界变应原的侵入。多种皮肤病的发生均与flg基因的突变相关，如鱼鳞病、特应性皮炎、银屑病等。其由3个外显子组成，其中1号和2号外显子较小，3号外显子较大。1号外显子(15bp)位于5'非翻译区，只有非翻译序列；2号外显子(159bp)包含起始密码子；3号外显子(12.7～14.7kb)为flg最重要的功能域，编码s100区域、b结合区域以及10～12个丝聚蛋白重复序列。重复序列间在dna水平的同源性近100％。

4、色素失禁症又叫做bloch-sulzberger病，是一种x连锁的显性遗传病，患儿一般在出生后2周左右，躯干两侧出现荨麻疹样、水疱样、疣状皮炎等症状。因为男性只有一个x染色体，所以男性病情严重，多在胎儿期死亡，所以患者一般为女性。此病常常伴有眼睛、骨骼和中枢神经系统异常，新生儿发病率约为1/50000。色素失禁症主要的致病基因为ikbkg，ikbkg又叫做nemo基因，位于xq28上，该区域基因组复杂，富含重复序列，由低复制重复率达到98％的两个35kb的序列组成，其中一个包含ikbkg基因，另一个包含非功能性ikbkgp假基因。因此，若进行色素失禁症的基因检测，真假基因的区分很重要。

5、多囊肾(polycystic kidneydisease，pkd)是一种常见的常染色体遗传病，是儿童和成人终末期肾病的常见原因，以双侧肾脏多发性进行性囊肿为主要特征。按照遗传方式可以分为：常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidneydisease，adpkd)和常染色体隐性遗传多囊肾病(autosomal recessive polycystickidney disease，arpkd)。adpkd一种成人发病的多系统疾病，以双肾多发、进行性增大的囊肿为主要表现，可同时伴有肾小球滤过功能减退、高血压、肝囊肿及脑动脉瘤。约45％的患者在60岁之前进展为终末期肾衰竭，占终末期肾病病因的7％～10％，是世界范围内肾脏替代治疗(renal replacement therapy，rrt)的第4大常见原因。其中pkd1和pkd2是比较常见的致病原因，约占adpkd患者的95％左右。值得注意的是pkd1基因exon1-33与位于附近的6个伪基因(pkd1p1、pkd1p2、pkd1p3、pkd1p4、pkd1p5、pkd1p6)的序列相似性约为97.7％；pkd2基因高gc；部分dna序列gc含量高达85％，基因扩增因难。

6、基于mlpa、sanger测序或二代测序等常见的方法可以实现smn1、flg、ikbkg、pkd1以及pkd2基因的检测。

7、关于几种测序方法：sanger测序主要用于已知变异信息的突变位点检测与验证，mlpa则用于某一基因单个外显子拷贝数的检测，而ngs测序更广泛、更便宜。

8、由于smn1与smn2基因之间、ikbkg与ikbkgp1之间高度同源性，flg基因内部重复序列间在dna水平的同源性近100％、pkd1/pkd2高同源高gc，易造成ngs假阳性结果。目前，smn1检测主要集中在7号和8号外显在的缺失检测，而由5％ smn1复合杂合突变所致的检测方法甚少，常用的方法是通过对smn1基因28kb左右全长进行扩增检测，这对dna质量以及扩增反应体系提出了更高的要求，使实验变得繁琐也极容易失败；而flg基因外显子3包含一系列相关但不相同的972bp丝聚蛋白单体序列串联重复，范围从10到12不等或是更罕见的重复数，这对检测造成了极大的困难，因此，基于目前的技术很难在同一检测体系中同时识别flg基因的所有相关变异，而且突变定位也不准确；ikbkg基因当前也无法实现在同一体系同时检测ikbkg基因所有点突变类型和结构变异类型；pkd1/pkd2高同源高gc，其检测主要集中在pkd1基因上，或采用多达几十对引物或几对扩增子大于20kb的长扩增子进行靶向检测，但是短扩增子越多若进行多重pcr扩增易形成交叉扩增、引物二聚体以及非特异扩增造成均一性差、数据有效率低等问题，而扩增子越长对dna质量要求越高，对扩增环境要求也严，易受气溶胶污染。

9、因此，本领域亟需开发出新型用于检测上述基因的引物组。

技术实现思路

1、基于此，有必要至少提供一种用于检测基因变异的核酸产品、试剂盒及装置和应用。

2、在本技术的第一方面，提供一种用于检测基因变异的核酸产品，所述核酸产品包括如下引物组中的一组或多组：第一引物组：序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示；第二引物组：序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示；第三引物组：序列分别如seq idno:5和seq id no:6所示；第四引物组：序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示；第五引物组：序列分别如seq id no:9和seq id no:10所示；第六引物组：序列分别如seq idno:11和seq id no:12所示；第七引物组：序列分别如seq id no:13和seq id no:14所示；第八引物组：序列分别如seq id no:15和seq id no:16所示；第九引物组：序列分别如seqid no:17和seq id no:18所示；第十引物组：序列分别如seq id no:19和seq id no:20所示；第十一引物组：序列分别如seq id no:21和seq id no:22所示；第十二引物组：序列分别如seq id no:23和seq id no:24所示；第十三引物组：序列分别如seq id no:25和seqid no:26所示；第十四引物组：序列分别如seq id no:27和seq id no:28所示；第十五引物组：序列分别如seq id no:29和seq id no:30所示；第十六引物组：序列分别如seq id no:31和seq id no:32所示；第十七引物组：序列分别如seq id no:33和seq id no:34所示；第十八引物组：序列分别如seq id no:35和seq id no:36所示；第十九引物组：序列分别如seq id no:37和seq id no:38所示；第二十引物组：序列分别如seq id no:39和seq idno:40所示；第二十一引物组：序列分别如seq id no:41和seq id no:42所示；第二十二引物组：序列分别如seq id no:43和seq id no:44所示；第二十三引物组：序列分别如seq idno:45和seq id no:46所示；第二十四引物组：序列分别如seq id no:47和seq id no:48所示；第二十五引物组：序列分别如seq id no:49和seq id no:50所示；第二十六引物组：序列分别如seq id no:51和seq id no:52所示；第二十七引物组：序列分别如seq id no:53和seq id no:54所示；第二十八引物组：序列分别如seq id no:55和seq id no:56所示；第二十九引物组：序列分别如seq id no:57和seq id no:58所示；第三十引物组：序列分别如seq id no:59和seq id no:60所示；第三十一引物组：序列分别如seq id no:61和seq idno:62所示；第三十二引物组：序列分别如seq id no:63和seq id no:64所示；第三十三引物组：序列分别如seq id no:65和seq id no:66所示；第三十四引物组：序列分别如seq idno:67和seq id no:68所示；第三十五引物组：序列分别如seq id no:69和seq id no:70所示；第三十六引物组：序列分别如seq id no:71和seq id no:72所示；第三十七引物组：序列分别如seq id no:73和seq id no:74所示；第三十八引物组：序列分别如seq id no:75和seq id no:76所示；第三十九引物组：序列分别如seq id no:77和seq id no:78所示；第四十引物组：序列分别如seq id no:79和seq id no:80所示。

3、在一些实施方式中，所述核酸产品包括如下引物组中的一组或多组：所述第一引物组、所述第二引物组、所述第三引物组、所述第四引物组、所述第五引物组、所述第六引物组、所述第七引物组、所述第八引物组、所述第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组、第十三引物组、第十四引物组、第十七引物组、第十八引物组、第十九引物组、第二十引物组、第二十二引物组、第二十三引物组、第二十四引物组、第二十五引物组、第二十六引物组、第二十七引物组、第二十八引物组、第二十九引物组、第三十引物组、第三十一引物组、第三十二引物组，以及第三十六引物组。

4、在一些实施方式中，所述基因选自由smn1、flg、ikbkg、pkd1和pkd2构成的群组。

5、在一些实施方式中，所述引物组满足如下1)～4)项所示特征中的一项或多项：

6、1)用于扩增所述smn1的引物组选自由所述第一引物组、所述第二引物组、所述第三引物组、所述第四引物组、所述第五引物组、所述第六引物组、所述第七引物组和所述第八引物组构成的群组；

7、2)用于扩增所述flg的引物组选自由所述第九引物组、所述第十引物组、所述第十一引物组、所述第十二引物组、所述第十三引物组、所述第十四引物组、所述第十五引物组、所述第十六引物组、所述第十七引物组、所述第十八引物组、所述第十九引物组、所述第二十引物组、所述第二十一引物组、所述第二十二引物组、所述第二十三引物组、所述第二十四引物组、所述第二十五引物组、所述第二十六引物组、所述第二十七引物组、所述第二十八引物组、所述第二十九引物组和所述第三十引物组构成的群组；

8、3)用于扩增所述ikbkg的引物组选自由所述第三十一引物组和所述第三十二引物组构成的群组；以及

9、4)用于扩增所述pkd1和/或所述pkd2的引物组选自由所述第三十三引物组、第三十四引物组、第三十五引物组、第三十六引物组、第三十七引物组、第三十八引物组、第三十九引物组和第四十引物组构成的群组。

10、在一些实施方式中，所述基因变异选自由单核苷酸变异、插入或缺失、外显子缺失和单体序列串联重复构成的群组。

11、在本技术的第二方面，提供一种试剂盒，其包含扩增体系；

12、所述扩增体系包含如第一方面所述的核酸产品，以及：缓冲液、dntp mix、dna聚合酶、gdna和无核酸酶水中的一种或多种。

13、在一些实施方式中，所述试剂盒检测基因变异相关疾病的方法包括pcr。

14、在一些实施方式中，所述方法还包括电泳和测序中的至少一种；所述测序可选地选自由一代测序、二代测序和三代测序构成的群组。

15、在本技术的第三方面，提供一种用于检测基因变异的装置，所述装置满足(1)～(2)所示特征中的一个或多个：

16、(1)采集使用如第一方面所述的核酸产品或者如第二方面所述的试剂盒对待测样本进行扩增后的序列信息；

17、(2)分析选自由smn1、flg、ikbkg、pkd1和pkd2构成的群组中的基因是否变异：包括分析所述基因上的单核苷酸变异、插入或缺失和外显子缺失/重复。

18、在本技术的第四方面，提供一种对选自由smn1、flg、ikbkg、pkd1和pkd2构成的群组中的基因进行测序的方法，所述方法包括使用如第一方面所述的核酸产品或者如第二方面所述的试剂盒对所述基因进行扩增。

19、在一些实施方式中，所述扩增条件包括：

20、94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，68℃延伸30s/kb，循环30～40次。

21、在本技术的第五方面，提供如第一方面所述的核酸产品、如第二方面所述的试剂盒或者如第三方面所述的装置在制备用于检测基因变异相关疾病的产品中的用途。

22、在一些实施方式中，所述基因变异相关疾病选自由脊髓性肌萎缩症、皮肤病、色素失禁症和多囊肾构成的群组。

23、本技术中的核酸产品、试剂盒以及装置至少能够有效解决假基因(高同源序列)存在对目标检测结果的干扰，使检测变得更加容易；所包括的不同引物组可以共用一个反应体系和扩增条件，无需额外添加pcr增强剂，使实验操作简单方便；靶向扩增产物既可以用于一代测序、也可以用于二代测序、还可以用于三代测序；可以根据需求多个场景同时应用，靶向扩增子三代测序实现区分顺式还是反式突变，以及突变是否具有连锁效应。