一种牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒的制备方法及其应用

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒的制备方法和应用。

背景技术：

1、喜树碱(camptothecin，cpt)是从喜树中分离出来的喹啉类生物碱，通过抑制dna拓扑异构酶ι(topι)的作用抑制癌细胞的复制。作为天然的topι抑制剂，cpt对肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌等多种癌症具有良好的抗肿瘤效果，在癌症的治疗上具有广泛的应用前景。但是，cpt存在水溶性差、不稳定、半衰期短、严重的毒副作用等问题，导致其在临床中的应用受到极大限制。

2、针对cpt在癌症治疗中存在的各种问题，目前已经开发出脂质体、聚合物胶束、纳米粒及微球等多种药物剂型，在不同程度上提高了cpt的溶解度、降低了毒性、提高了生物利用度。但由于载体材料的影响，药物在体内的递送受到限制，如脂质体中的磷脂易氧化使结构解体而可能引发毒副作用，聚合物胶束的稳定性较差易引发药物泄露造成血管堵塞等问题。因此，选取合适的药物载体提高cpt的溶解性、延长体内循环时间和增强肿瘤靶向性仍是提高其治疗效果的关键。

3、近年来，纳米药物递送系统的发展为解决这些问题提供了新的思路。其中，血清白蛋白(sa)作为一种天然、可生物降解的载体材料，因其良好的生物相容性和靶向性而受到广泛关注。目前分离出的sa主要有牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)和大鼠血清白蛋白(rsa)。其中，bsa和hsa因具有安全无毒性、无免疫原性、生物相容性、生物降解性等优点，广泛应用于药物输送研究。与hsa相比，bsa来源更加广泛、成本低，常作为hsa的替代物用于临床前模型研究。将喜树碱类药物与牛血清白蛋白(bsa)结合制备成纳米粒，可以提高药物的水溶性和稳定性、提高治疗效、降低药物毒性等。

4、聚乙二醇(peg)是极少数被fda批准的能用作体内注射药用合成聚合物之一。peg水溶液的ph呈中性、易溶于水和极性溶剂，无毒、无免疫原性，生物相容性，还可以通过共价键或非共价键偶联修饰蛋白质、脂质体等，从而改变药物的药动学性质。经peg修饰后，大多数蛋白质的性质变化如下：(1)降低免疫原性与抗原性；(2)延长循环半衰期最高至50倍；(3)溶解性增加；(4)耐蛋白酶水解；(5)毒性减少；(6)稳定性增加。采用peg对bsa进行修饰，制备peg-bsa-cpt纳米粒，修饰后的纳米粒子由于其可以避免网状内皮系统的清除，延长药物在体内的循环时间，进一步提高cpt溶解性和稳定性。

5、目前，血清白蛋白纳米粒给药系统的制备方法主要有去溶剂化法、基于二硫键形成的白蛋白纳米技术(nabtm－技术)技术、自组装技术等。自组装技术制备血清白蛋白纳米粒需要使用还原剂，但还原剂存在潜在毒性；去溶剂化法需要使用交联剂戊二醛对纳米粒进行固定处理，残留的戊二醛易对人体造成损害；nabtm技术是水相与有机相在高压均质条件下实现乳化的过程，但高压均质可能改变蛋白的二级和三级结构，导致蛋白质展开或变性。

技术实现思路

1、本发明克服了上述血清白蛋白纳米粒给药系统的制备方法的弊端，在nabtm技术的基础上进行改变，采用冷冻干燥-超声法代替高压均质实现乳化过程。采用冷冻干燥-超声法制备血清白蛋白载药纳米粒，避免血清白蛋白的展开或变性，工艺简单、重复性好、绿色环保。

2、鉴以此，本发明目的是提供一种聚乙二醇修饰牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒的制备方法，采用冷冻干燥-超声法，制备方法如下：

3、步骤一，将mpeg-nhs溶于水中，在搅拌条件下缓慢加入到bsa水溶液中，反应在室温下进行12h，将得到的共轭物(peg-bsa)采用去离子水透析去除未反应的mpeg-nhs，冻干并在-20℃保存至使用。

4、步骤二，称取cpt溶于氯仿与无水乙醇的混合溶液中作为有机相，步骤一得到的peg-bsa溶于水作为水相，二者混合，搅拌均匀，得到初步包封喜树碱的peg-bsa纳米粒溶液。

5、步骤三，将步骤二得到的包封喜树碱的peg-bsa纳米粒溶液迅速冷冻至-80℃以下，形成冻液，冷冻干燥得到peg-bsa-cpt纳米粒。

6、步骤四，将步骤三得到的冻干peg-bsa-cpt纳米粒重新溶解于适量去离子水或pbs缓冲液中，超声处理，干燥机冻干，即得聚乙二醇修饰牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒(peg-bsa-cpt-nps)。

7、优选的，步骤一中，bsa浓度为2～10mg/ml，mpeg-nhs与bsa摩尔比为20:1。

8、优选的，步骤二中，氯仿与无水乙醇体积比为(1～9):1。

9、优选的，步骤二中，cpt浓度为0.53～4.8mg/ml。

10、优选的，步骤二中，水相与有机相体积比为(5～30):1。

11、优选的，步骤二中，水相溶液ph5～8。

12、优选的，步骤四中，超声时间为4～12min，超声功率为45％～75％。

13、本发明提供一种由上述制备方法制备所得的牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒。

14、本发明另一个目的是，提供了一种牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒在制备抗癌药物中的应用。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

16、1.本发明通过聚乙二醇(peg)修饰bsa，增强了纳米粒的生物相容性和稳定性，制备得到peg-bsa-cpt-nps，提高cpt水溶解度近10倍的同时延长药物的循环时间，提高了cpt的抗肿瘤活性。

17、2.本发明在nabtm技术的基础上进行改变，为避免高压均质造成的改变蛋白的二级和三级结构，导致蛋白质展开或变性的缺点，采用冷冻干燥-超声法代替高压均质实现乳化过程。采用冻干法避免了高温或有机溶剂对药物活性的破坏，同时通过调整超声工艺参数，能够有效控制纳米粒的粒径。所得peg-bsa-cpt-nps的纳米粒粒径符合纳米药物理想尺寸的标准，能够穿透肿瘤微环境并避免被快速清除。

18、3.本发明在传统的超声乳化法基础上引入了冷冻干燥步骤，先将载药纳米粒冷冻干燥成粉末，再进行超声处理。第一步冻干的过程在避免有机溶剂残留、提高纳米粒稳定性、方便后续处理、减少污染风险以及改善相分散方面起到了关键作用；同时还能保持药物结构的完整性，提高了药物的包封效率和稳定性，尤其对于难溶性药物喜树碱而言，这种方法能够有效减少药物在制备过程中的流失，并确保其在靶向部位的有效释放。

技术特征：

1.一种牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，bsa浓度为2～10mg/ml，mpeg-nhs与bsa摩尔比为20:1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，氯仿与无水乙醇体积比为(1～9):1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，cpt浓度为0.53～4.8mg/ml。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，水相与有机相体积比为(5～30):1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，水相溶液ph5～8。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，超声时间为4～12min，超声功率为45％～75％。

8.一种如权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到的牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒。

9.一种如权利要求8所述的牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒在制备抗癌药物中的应用。

技术总结本发明涉及一种牛血清白蛋白负载喜树碱纳米粒的制备方法，通过PEG修饰BSA，增强了纳米粒的生物相容性和稳定性，制备得到PEG‑BSA‑CPT‑NPs，提高CPT水溶解度近10倍。采用冷冻干燥‑超声法代替高压均质实现乳化过程，从而避免高压均质造成的改变蛋白的二级和三级结构，导致蛋白质展开或变性的缺点。另外，在传统的超声乳化法基础上引入了冷冻干燥步骤，先将载药纳米粒冷冻干燥成粉末，再进行超声处理。本发明所制备的PEG‑BSA‑CPT‑NPs的纳米粒粒径符合纳米药物理想尺寸的标准，能够穿透肿瘤微环境并避免被快速清除，提高了CPT的抗肿瘤活性。技术研发人员：宋芸,苏文琴,黎俊峰受保护的技术使用者：海南医科大学（海南省医学科学院）技术研发日：技术公布日：2024/12/23