一种发酵生产D-泛醇的方法

本发明涉及微生物发酵，尤其涉及一种发酵生产d-泛醇的方法。

背景技术：

1、泛醇又称维生素原b5，化学分子式c9h19no4，相对分子量205.25，其溶液的黏度较大在40℃时的粘度就在10000厘泊以上。泛醇可分为混旋体(dl-型)、右旋体(d-型)和左旋体(l-型)3种形式，其中，只有d-泛醇具有生物活性。d-泛醇是维生素b5(泛酸)的前体，也是d-泛酸的同效物，广泛的应用于医药、食品、液体制剂、以及化妆品行业中。目前，寻找一种高效合成d-泛醇的方法具有重要的现实意义。

2、d-泛醇在微生物、植物、动物体内广泛存在，由d-泛解酸内酯和3-氨基丙醇在泛酸内酯水解酶的作用下生成，其中生物体内编码泛酸内酯水解酶的基因多为panc基因。d-泛醇再经一系列的生物化学反应可生成d-泛酸(维生素b5)，然后作为合成酰基载体蛋白(acp)和辅酶a(coa)的重要前体进入到tca循环中。

3、现有的d-泛醇的制备方法主要是化学合成法和微生物酶法。化学合成法大多是以d-泛解酸内酯和3-氨基丙醇为原料，在有溶剂或无溶剂的条件下通过酰化反应来合成d-泛醇。微生物酶法大多是通过微生物过表达相应的酶，经分离纯化后用于d-泛醇的生产。

4、现有技术中，申请公布号为cn101851171a的中国专利公开了一种无溶剂制备d-泛醇的方法，该专利将d-泛解酸内酯和3-氨基丙醇在无溶剂条件下反应，得到了高纯度的d-泛醇，虽然此方法省去了分离溶剂的步骤并且得到的d-泛醇的光学纯度较高，但这种方法对于原料的要求较高，且其在无溶剂条件下所得的d-泛醇的黏度较大造成原料直接反应会逐渐变缓，导致产品的收率较低，且其较高的黏度也不利于后续的操作和利用，得到的产品的实际利用率较低。

5、通过微生物酶法来制备d-泛醇在专利cn1173042c中有所提及，其利用一株高产d-泛解酸内酯水解酶的串珠镰孢霉菌(fusarium moniliforme)进行发酵，得到d-泛解酸内酯水解酶，用该菌株所生产的酶去水解底物d-泛解酸内酯和3-氨基丙醇得到目的产物d-泛醇。此方法克服了化学法生产d-泛醇成本高、有污染、有毒性和光学纯度不高的缺点。但此方法也有着许多缺点，其一，用微生物所产的酶去催化d-泛解酸内酯和3-氨基丙醇进行反应产泛醇需要将酶进行一定的分离纯化，这大大提高了操作成本和生产效率；其二，酶的稳定性较差，只有在最适条件下才能最好的发挥酶的催化活力，且酶易失活，不利于工业的大规模生产和应用。

技术实现思路

1、为了解决上述高效合成d-泛醇的技术问题，本发明提供了一种发酵生产d-泛醇的方法。

2、本发明的具体技术方案为：

3、本发明提供了一种发酵生产d-泛醇的方法，包括以下步骤：

4、步骤s1：在底盘菌中过表达panc基因，得到dfc01菌株；

5、步骤s2：将所述dfc01菌株接种培养，得到种子液；

6、步骤s3：将所述种子液接种至发酵培养基中发酵培养；

7、所述发酵培养进行以下条件的控制：

8、在12～24小时期间，流加一类补料培养基，并通过控制补料速度使发酵液中葡萄糖的浓度处于0.5～2g/l范围；

9、在24小时至发酵结束期间，流加二类补料培养基，并通过控制搅拌速度使发酵液中溶氧浓度处于28％～40％范围。

10、针对现有工艺存在的d-泛醇光学纯度不高，且难以实现大规模的工业化应用的问题，本技术通过对改造菌株dfc01菌株进行发酵生产d-泛醇，并基于dfc01菌株，设计了适合其大规模发酵生产d-泛醇的多阶段控制发酵工艺，通过发酵中期12～24小时期间，控制发酵液中葡萄糖的浓度处于0.5～2g/l范围，以及，通过发酵后期24小时至发酵结束期间，控制发酵液中溶氧浓度处于28％～40％范围，使得降低发酵过程中副产物积累的同时，提高d-泛醇产量以及糖酸转化率。

11、作为上述方法的优选，在12～24小时期间，流加一类补料培养基，并通过控制补料速度使发酵液中葡萄糖的浓度处于0.8～1.5g/l范围。

12、作为上述方法的优选，在24小时至发酵结束期间，流加二类补料培养基，并通过控制搅拌速度使发酵液中溶氧浓度处于32％～35％范围。

13、作为上述方法的优选，所述控制搅拌速度使转速为400～700r/min。

14、作为上述方法的优选，一类补料培养基组成为：葡萄糖300g/l，硫酸镁8g/l，磷酸二氢钾14g/l，硫酸铵10g/l，维生素b12 0.002g/l，维生素b1 0.005g/l，异亮氨酸0.08g/l，盐溶液2ml/l，iptg 1mol/l。

15、作为上述方法的优选，二类补料培养基组成为：葡萄糖200g/l，硫酸镁6g/l，磷酸二氢钾7g/l，3-氨基丙醇15g/l，硫酸铵10g/l，维生素b12 0.002g/l，维生素b1 0.005g/l，异亮氨酸0.08g/l，盐溶液2ml/l，表面活性剂10ml/l。

16、作为上述方法的优选，所述发酵培养的温度为28.0～32.0℃，所述发酵培养的ph为6.5～7.0。

17、作为上述方法的优选，步骤s1中，panc基因来源于大肠杆菌escherichia coliw3110、枯草芽孢杆菌bacillus subtilis、地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis、谷氨酸棒状杆菌corynebacterium glutamicum、串珠镰孢霉菌fusarium moniliforme。

18、作为上述方法的优选，步骤s2中，种子液的培养时间为10～15h。

19、作为上述方法的优选，步骤s3中，种子液接种量为发酵培养基体积的10％～15％。

20、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

21、(1)本发明通过对改造菌株dfc01菌株进行发酵生产d-泛醇，并基于dfc01菌株，设计了适合其大规模发酵生产d-泛醇的多阶段控制发酵工艺，通过发酵中期12～24小时期间，控制发酵液中葡萄糖的浓度处于0.5～2g/l范围，以及，通过发酵后期24小时至发酵结束期间，控制发酵液中溶氧浓度处于28％～40％范围，使得降低发酵过程中副产物积累的同时，提高d-泛醇产量以及糖酸转化率。

22、(2)本发明提供的方法，针对dfc01菌株，给出了最优的生产的d-泛醇的发酵条件，并采用了双补料方法，在接种12h～24h期间进行一类补料，在接种24h～发酵结束期间进行二类补料，加入3-氨基丙醇和表面活性剂，使得菌株充分生长的同时，兼顾过表达泛酸合成酶，有效的避免了只长菌不合成代谢产物的情况出现，提高了发酵罐整体产d-泛醇的能力，最终使得高效合成d-泛醇。本发明方法可以为其他工程菌发酵高效生产d-泛醇提供指导。

23、(3)本发明提供的方法基于微生物发酵进行，具有绿色无污染的优点，同时，以本发明提供的方法d-泛醇产量以及糖酸转化率高，且与现有的d-泛醇生产工艺相比光学纯度较高，可达99.8％，另外，本发明方法实施简便，适合工业上大规模生产d-泛醇。