一种双分裂适体探针及其应用

本发明涉及属于分子生物学与临床医学领域，涉及一种双分裂适体探针及其应用。

背景技术：

1、夹心免疫测定法是一种通用的检测方法，其检出限低、特异性高，具有广泛的应用前景。但是这种测定方法要求分析物至少具有两个可以同时结合两种抗体的表位。然而，由于尺寸有限，小分子通常被认为是单价的，无法同时结合两种抗体。因此，夹心免疫分析大多是用来检测蛋白质等大分子，而很难对分子量小于1000的小靶标进行检测。与抗体相比，适体具有分子质量小、分子修饰灵活、可在室温下长期保存、变性和复性后可重复使用等优点，为克服抗体的局限性提供了可能性，在小分子检测的特殊情况下，适体相对于抗体具有更大的优势，被认为是抗体的有前途的替代品。适体识别是基于分子间作用力，例如静电相互作用、氢键等，对小分子有很强的亲和力和选择性。但是适体由于其核苷酸序列过长，往往倾向于折叠成非特异的二级结构，可能与其他物质结合，产生假阳性或非特异性信号，这显然不利于建立一个特异性强的检测方法。其次，传统的小分子适体只有一个结合表位甚至部分表位，这给设计同时具有捕获功能和信号报告的夹心式传感器带来了挑战。

2、为了解决上述完整适体的难点，提高适体的特异性和敏感性。科学家提出了分离式适体的概念，即创造性地将一个完整的适体分成两个片段。分裂适体比完整适体序列更短，可以避免空间位阻的缺点。并且分裂适体由于缺乏二级结构，在没有靶标存在时会分散，只有在靶标存在时，适体才能够重新组装成与之特异性结合的完整复合物，这种技术能够有效地避免假阳性或非特异性信号的产生。例如白云峰等人首次借助分裂适体的高特异性以及氧化石墨烯与设计的适体序列的两种状态之间独特的相互作用，构建了腺苷的开启/猝灭荧光适体传感器，检测限为6μ(osypovaa,thakar d,dejeu j,et al.sensor basedon aptamer folding to detect low-molecular weight analytes[j].analyticalchemistry,2015,87(15):7566-7574)。尽管该方法实现了简单的检测，但由于目标输入和信号输出之间的比率为2:1，灵敏度较低。

3、与线性hcr相比，非线性杂交链式反应(nhcr)由于形成分支纳米结构而具有更高的扩增效率，并且简化了无酶操作。杨甜甜等人成功利用了适体邻近杂交的特异性优势以及nhcr的高灵敏度开发了一种共定位触发的dna纳米组装策略用于放大成像(qi c,bingt,mei h,et al.g-quadruplex aptamers for zeatin recognizing[j].biosensors andbioelectronics,2013.299(13):157-162.)。该方法在确保特异性的同时保证了更高的检测灵敏度。

4、细胞外三磷酸腺苷(atp)和ade等ade衍生物因其在肿瘤间质中的高浓度水平成为公认的癌症生化标志物。在正常生理条件下细胞外atp水平处于低nm水平，但在肿瘤基质和附近区域增加至μm水平。癌细胞会整合激活(atp)和抑制(ade)信号通路，从而产生“最终”的ade衍生物浓度结果。ade作为人类肿瘤标志物在正常人与癌症患者体内含量的差异。如ade在人体内的正常含量为0.18μm-4.7μm，结直肠癌患者中的ade浓度是健康人的近3倍。然而，目前市售的ade衍生物检测试剂盒的检测限仅为微克级别，其检测灵敏度无法满足癌症临床监测的需求，并且多是酶联免疫检测，操作过程复杂，需要严格控制实验环境。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建一种高灵敏度的双分裂适体探针及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种双分裂适体探针，包括两个分裂适体，分别为分裂适体1和分裂适体2，分裂适体1包括适体片段1和分裂引发剂1，分裂适体2包括适体片段2和分裂引发剂2，两个适体片段来自一个完整的适体序列a；所述适体片段1和适体片段2具有识别目的靶标的能力，所述分裂引发剂1和分裂引发剂2具有启动nhcr的功能。

4、该探针能够特异性识别靶标，在靶标存在的情况下，探针能够形成三明治结构，使两段相互独立的引发剂彼此靠近，协同诱导非线性杂交链反应(nonlinear hybridizationchain reaction，nhcr)，实现微量小分子检测信号的二次或指数生长。与典型的nhcr的引发剂是完整的不同，本发明中的引发剂被分成两部分，可以由ade共同诱导。因此，在没有ade的情况下，它可以被有效地抑制。首先，可以通过将完整的适体序列切割成两个片段来构建分裂适体，然后与nhcr方法结合，以构建简便且通用的小分子检测平台。双分裂适体探针由两个序列组成，每个序列可以细分为具有不同功能的两个片段，一个片段源自分裂适体，具有识别ade的能力，另一片段源自分裂引发剂以启动nhcr。在游离状态下，两个序列彼此分开，单独的分裂引发剂不能启动nhcr，从而留下具有猝灭荧光的稳定探针。但在ade存在的情况下，两条分裂适体可以结合两分子的ade，并根据“诱导契合效应”重新组装成特定的构型。然后，双分裂适体探针的识别驱动重塑可以将两段分裂引发剂拉近，作为完整的引发剂触发nhcr过程。

5、在其中的一个优选的实施例中，分裂适体1和分裂适体2的摩尔比例为1-2:1-2。

6、在其中的一个优选的实施例中，所述适体片段2的序列如acctgggggagtat；分裂引发剂2的序列为gatcaagcagt；适体片段1的序列如tgcggaggaaggt；分裂引发剂1的序列为gtcgaagtagtt；适体序列a的序列为acctgggggagtattgcggaggaaggt。

7、分裂引发剂和适体片段之间不能相互干扰。

8、本发明还要求保护所述双分裂适体探针在制备检测腺苷或腺苷衍生物的试剂或试剂盒中的应用。

9、本发还要求保护所述双分裂适体探针在制备检测结直肠癌、前列腺癌或肺癌的试剂或试剂盒中的应用。

10、一种检测腺苷或腺苷衍生物的试剂或试剂盒，每一份检测量包括10μl at1溶液，10μl at2溶液，16.5μl buffer，1μl fa溶液，1μl fb溶液，1.5μl qa溶液，3μl qb溶液，2μlaa溶液和4μl ab溶液；

11、所述at1的序列如seq id no.1所示，所述at2的序列如seq id no.2所示，所述fa的序列如seq id no.3所示，所述fb的序列如seq id no.4所示，所述qa的序列如seq idno.5所示，所述qb的序列如seq id no.6所示，所述aa的序列如seq id no.7-11所示，所述ab的序列如seq id no.12所示。

12、一种检测结直肠癌、前列腺癌或肺癌的试剂或试剂盒，每一份检测量包括10μlat1溶液，10μl at2溶液，16.5μl buffer，1μl fa溶液，1μl fb溶液，1.5μl qa溶液，3μl qb溶液，2μl aa溶液和4μl ab溶液；

13、所述at1的序列如seq id no.1所示，所述at2的序列如seq id no.2所示，所述fa的序列如seq id no.3所示，所述fb的序列如seq id no.4所示，所述qa的序列如seq idno.5所示，所述qb的序列如seq id no.6所示，所述aa的序列如seq id no.7-11所示，所述ab的序列如seq id no.12所示。

14、在其中的一个优选的实施例中，所述aa的序列如seq id no.8所示。

15、在其中的一个优选的实施例中，所述at1溶液、at2溶液、fa溶液、fb溶液，qa溶液、qb溶液、aa溶液和ab溶液的溶剂均为buffer溶液。

16、在其中的一个优选的实施例中，所述buffer溶液中包括：1ml 50×tae溶液，0.625ml mg2+溶液，48.375ml水，ph为8.0。

17、在其中的一个优选的实施例中，at1溶液、at2溶液、fa溶液、fb溶液，qa溶液、qb溶液、aa溶液和ab溶液的浓度为0.5-1.0μm。

18、以下对本发明做进一步的解释：

19、本发明以腺苷(ade)为模型，设计了双分裂适体探针。首先，可以通过将完整的适体序列切割成两个片段来构建分裂适体，然后与nhcr方法结合，以构建简便且通用的小分子检测平台。双分裂适体探针由两个序列组成，每个序列可以细分为具有不同功能的两个片段，一个片段源自分裂适体，具有识别ade的能力，另一片源自分裂引发剂以启动nhcr。在游离状态下，两个序列彼此分开，单独的分裂引发剂不能启动nhcr，从而留下具有猝灭荧光的稳定探针。但在ade存在的情况下，两条分裂适体可以结合两分子的ade，并根据“诱导契合效应”重新组装成特定的构型。然后，双分裂适体探针的识别驱动重塑可以将两段分裂引发剂拉近，作为完整的引发剂触发nhcr过程。因此，荧光探针(由荧光团标记的fa和fb)可以连续打开并产生具有激活荧光的分支装荧光树，使ade的检测信号得到扩增，如图1所示。

20、本发明证明了在靶标的触发下，dna能够在溶液中成功自组装形成分子量更大的荧光树，实现信号扩增。在dna自组装过程中，通过优化辅助链a的链长，发现在原有基础上减少1个碱基后，可以降低nhcr自组装的背景信号。

21、构建的三明治型荧光传感器能够成功应用于ade的检测，在0.01-100ng/ml浓度范围内，测得的荧光强度随着ade的浓度的增加而增强，线性回归方程为：y＝499.77x-323.9(r2＝0.9951)，线性良好，lod不高于5.23pg/ml，检测时间不多于30min。与最近新报导的检测ade的方法相比，仍然有着较高灵敏度和较短检测时间的优势。并且已证实该方法能够在复杂样本中对ade进行准确定量。