一种叶酸片中有关物质的检测方法与流程

本技术涉及药物分析的，尤其是涉及一种叶酸片中有关物质的检测方法。

背景技术：

1、叶酸片(0.4mg)是一种以叶酸为主要成分的药品，可用于预防胎儿先天性神经管畸形，为妊娠期、哺乳期女性预防用药，研究表明准妈妈在备孕期间就服用可以下降胎儿神经管畸形率85％，此项结果至今被全球50多个国家广泛应用。杂质研究是贯穿于药品生命周期的重点药学研究内容，作为孕妇服用的药物，其杂质谱的研究尤为关键。

2、为保障药物安全有效，开展药物稳定性试验，叶酸片长期稳定性放样过程中检测到叶酸相对保留时间约4.5倍的杂质，含量呈上升趋势且超过制剂0.2％的鉴定阈值，ich指南表明超过0.2％限度的杂质量已经达到可能对人体造成危害的限度，应对该杂质进行结构鉴定和含量的控制。

3、目前，该杂质属于未知杂质，并且没有控制该未知杂质的分析方法，因此，如何有效控制该杂质的分析方法成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、如背景技术所述，叶酸片在稳定性试验中产生未知杂质，含量呈上升趋势且超过制剂0.2％的鉴定阈值，目前没有针对叶酸片中该未知杂质含量的检测方法。采用本技术的方法对叶酸片进行分离纯化得到目标杂质，命名为杂质3，后续综合解析杂质的红外光谱、质谱及核磁共振谱图(质谱图见图1)，确证该杂质结构如下：

2、

3、针对现有技术的不足，本技术提供一种用于检测叶酸片中有关物质(杂质3)含量的hplc检测方法，该hplc检测方法专属性强、准确、精密、灵敏，可用于叶酸片的研发和生产中的质量控制，提高药品质量与安全性，保障临床用药安全。

4、本技术提供一种叶酸片中有关物质的检测方法，采用如下的技术方案：

5、一种叶酸片中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法对叶酸片中有关物质进行检测，其中，所述有关物质为式1所示的杂质(即杂质3)；

6、

7、优选的，高效液相色谱法的色谱条件如下：

8、优选的，色谱柱：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

9、流动相为组分a和组分b的混合物；

10、其中，组分a为1％(g/ml)-1.2％(g/ml)磷酸二氢钾和0.4％(g/ml)-0.7％(g/ml)磷酸氢二钾的混合溶液；用磷酸或5mol/l氢氧化钾调节ph值为6.4±0.2；

11、组分b为甲醇；

12、洗脱方式：等度洗脱。

13、优选的，所述流动相中，组分a和组分b的体积比为(85-90):(15-10)。

14、进一步优选的，所述流动相中，组分a和组分b的体积比选自85:15、86:14、87:13、88:12、89:11或90:10；更优选的，所述流动相中，组分a和组分b的体积比为90:10。

15、优选的，所述流动相中，组分a为1.116％(g/ml)磷酸二氢钾和0.55％(g/ml)磷酸氢二钾的混合溶液。

16、优选的，采用高效液相色谱法进行检测时，检测波长为275-285nm。

17、进一步优选的，检测波长选自275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm；更优选的，检测波长为280nm。

18、优选的，采用高效液相色谱法进行检测时，进样量为10-20μl。

19、进一步优选的，进样量选自10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl或20μl；更优选的，进样量为10μl。

20、优选的，采用高效液相色谱法进行检测时，色谱柱柱温为25-30℃。

21、进一步优选的，色谱柱柱温选自25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃；更优选的，色谱柱柱温为25℃。

22、优选的，流动相流速为0.5-1ml/min。

23、进一步优选的，流动相流速选自0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min或1ml/min；更优选的，流动相流速为0.6ml/min。

24、优选的，所述色谱柱为merck 100rp-8；色谱柱的长度为250mm，直径为4.0mm，填料粒径为5μm；或等效色谱柱。

25、优选的，一种叶酸片中有关物质的检测方法，检测方法步骤如下：

26、(1)配制系统适用性溶液：取式1所示的杂质和叶酸对照品适量，先加2.86％(g/ml)碳酸钠溶液置棕色量瓶中，超声使溶解，再加流动相稀释成每1ml中约含叶酸0.5mg与式1所示的杂质2.5μg的溶液，作为系统适用性溶液；

27、(2)配制供试品溶液：取本品细粉适量(约相当于叶酸10mg),置20ml棕色量瓶中，加2.86％(g/ml)碳酸钠溶液5ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，离心(每分钟4000转)10分钟，取上清液过滤，取续滤液作为供试品溶液；

28、(3)配制对照溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml棕色瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液；

29、(4)取系统适用性溶液、供试品溶液及对照溶液注入高效液相色谱仪，检测式1所示的杂质的含量。

30、在一个具体的可实施方案中，一种叶酸片中有关物质的检测方法，步骤如下：

31、(1)溶液配制：(应避光操作)

32、系统适用性溶液：取杂质3(式1所示的杂质)和叶酸对照品适量，先加2.86％(g/ml)碳酸钠溶液置棕色量瓶中，超声使溶解，再加流动相稀释成每1ml中约含叶酸0.5mg与杂质3 2.5μg的溶液，作为系统适用性溶液；

33、供试品溶液：取样品细粉适量(约相当于叶酸10mg)，置20ml棕色量瓶中，加2.86％(g/ml)碳酸钠溶液5ml，超声10min使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，离心(每分钟4000转)10分钟，取上清液过滤，取续滤液作为供试品溶液。

34、对照溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml棕色量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

35、(2)色谱条件：

36、色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，merck 100rp-8(250mm×4.0mm，5μm)或等效色谱柱；

37、流动相：1.116％(g/ml)磷酸二氢钾和0.55％(g/ml)磷酸氢二钾的混合溶液-甲醇，其中混合溶液和甲醇的体积比为90:10；用磷酸或5mol/l氢氧化钾调节混合溶液的ph值为6.4±0.2，；

38、检测波长：280nm；进样量：10μl；柱温：25℃；流速：0.6ml/min；采集时间：主成分峰保留时间的7倍；

39、溶样溶剂：2.86％(g/ml)碳酸钠溶液(取无水碳酸钠约2.86g，加水溶解并稀释至100ml)；洗脱方式：等度洗脱。

40、(3)计算公式如下：

41、杂质3含量％＝(a×f)/as×1％；

42、其中：a为供试品溶液中杂质3峰面积；

43、as为对照溶液中主峰面积；

44、f为杂质3的校正因子；校正因子见实施例中方法线性验证结果；

45、(4)限度

46、供试品色谱图中，杂质3含量不超过0.5％。

47、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

48、本技术中提供了一种叶酸片中有关物质的检测方法，用于检测叶酸片中杂质3的含量，该方法的专属性强、准确、精密、灵敏，可以有效控制叶酸片中的杂质3的含量。