一种基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法及应用

本发明涉及瓜实蝇转基因工程，特别涉及一种基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法及应用。

背景技术：

1、在遗传学和生物技术领域，对于基因转化和遗传筛选标记的研究一直是重要的课题。瓜实蝇(bactrocera cucurbitae)是双翅目实蝇科的昆虫，广泛分布于热带和亚热带地区。它主要以幼虫在瓜果内部取食为害，导致瓜果腐烂、变质，给果蔬种植业造成了严重的经济损失。瓜实蝇具有较强的繁殖能力和适应性，其生命周期短，世代重叠严重，这使得其防控工作面临巨大挑战。

2、构建瓜实蝇遗传筛选标记具有极其重要的意义。首先，精准有效的筛选标记能够帮助科研人员准确地识别和分离具有特定遗传特征的瓜实蝇个体，从而深入探究其遗传变异规律和进化机制。这对于揭示瓜实蝇的种群结构、扩散模式以及对环境的适应能力等方面具有关键作用。其次，通过筛选标记可以快速定位与抗药性、繁殖力等重要生物学特性相关的基因，为研发更高效、环保的害虫防治策略提供重要的理论依据和技术支持。再者，在基因功能研究中，筛选标记能够助力鉴定和分析关键基因的作用，推动对瓜实蝇生长发育、行为习性等方面的深入理解。此外，筛选标记还有助于监测田间瓜实蝇种群的动态变化，为及时采取防控措施提供决策依据，从而有效减少其对农业生产的危害。

3、昆虫基因工程需要从大量的样本中筛选成功插入到基因组的真阳性个体，工作量庞大复杂，因此需要借助可视的筛选标记来减轻负担。在瓜实蝇的研究中，以往的遗传筛选标记方法存在诸多问题。传统的荧光蛋白标记法，需要特定的仪器设备来检测荧光，不仅增加了实验成本，而且对实验环境有较高要求。在筛选过程中，由于荧光蛋白标记需要在特定的激发光下观察，这就限制了观察的便捷性和灵活性。而且，对于实验人员来说，长时间在暗室中观察荧光，对眼睛健康造成不利影响。另外，一些传统的遗传筛选标记方法在筛选时期的选择上也存在困难。幼虫期的瓜实蝇处于活跃的生长和移动状态，难以集中观察和筛选；而成虫期的瓜实蝇活动范围较大，增加了筛选的难度。此外，某些标记方法的表型差异不够明显，导致转化子难以准确分辨，从而影响筛选的准确性和效率。一些标记基因可能会干扰目的基因的正常表达和功能，或者与目的基因发生重组等，从而影响实验结果的准确性和可靠性。蛹色变化作为一种潜在的筛选标记，由于技术手段和研究方向的限制，之前未能将其有效应用于瓜实蝇的遗传筛选中。

4、综上所述，针对瓜实蝇的遗传筛选标记研究仍需进一步探索和创新，以克服现有方法的局限性，提升筛选效率和准确性。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提出一种基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法及应用。

2、为了达到以上目的，本发明方案如下：

3、一种基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法，包括以下步骤：

4、使用seq id no.1和seq id no.2所示的引物序列从addgene 24353载体上扩增质粒骨架；

5、使用seq id no.3和seq id no.4所示的引物序列扩增xm_054231212基因序列的5’utr及cds序列；

6、使用seq id no.5和seq id no.6所示的引物序列扩增loc105216239基因序列的5’utr上游2000bp序列；

7、通过无缝克隆组装扩增得到的各片段，获得wprp载体，筛选，获得wprp质粒；

8、将wprp质粒与转座辅助酶质粒phelper混合，得质粒溶液；

9、将质粒溶液注射入瓜实蝇白蛹品系的卵中，卵发育为成虫后，繁殖的后代化蛹时出现棕色蛹。

10、进一步的，wprp质粒与转座辅助酶质粒phelper的质量比为1～3:1。

11、进一步的，所述繁衍的后代包括：经过g0代自交或与白蛹品系异性杂交获得的后代。

12、所述基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法在判断转基因是否成功中的应用。

13、进一步的，所述基因包括gal4基因。

14、进一步的，所述的应用，包括以下步骤：

15、将gal4基因构建至所述的wprp质粒，得转基因质粒，利用piggybac转基因技术将质粒转入白蛹瓜实蝇基因组中，繁育的后代若出现棕蛹，则代表gal4基因转基因成功。

16、进一步的，所述繁衍的后代包括：经过g0代自交或与白蛹品系异性杂交获得的后代。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、本发明创造性的将瓜实蝇蛹色恢复作为筛选标记，仅需肉眼观察就能分辨出阳性转化子，极大提高了筛选效率。我们构建的瓜实蝇白蛹蛹色恢复品系，克服了荧光蛋白标记的缺陷：(1)它将筛选时期定位在幼虫和成虫之间的蛹时期，化蛹后的瓜实蝇不会移动，方便观察筛选；(2)瓜实蝇的蛹色显性表型为棕蛹，隐性表型为白蛹。表型差异明显，转化子容易分辨；(3)肉眼观察即可区分表型，不会对昆虫带来损伤；(4)方便快捷，不受限于仪器的辅助；(5)不需研究人员长时间在暗室中观察荧光，有利于研究人员用眼健康。

技术特征：

1.一种基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法，其特征在于，wprp质粒与转座辅助酶质粒phelper的质量比为1～3:1。

3.根据权利要求1所述的基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法，其特征在于，

4.权利要求1所述的基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法在判断转基因是否成功中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因包括gal4基因。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述繁衍的后代包括：经过g0代自交或与白蛹品系异性杂交获得的后代。

技术总结本发明提出了一种基于蛹色变化的瓜实蝇遗传筛选标记的构建方法及应用。所述构建方法包括以下步骤：使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列从Addgene 24353载体上扩增质粒骨架；使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列扩增XM_054231212基因序列的5’UTR及CDS序列；使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物序列扩增LOC105216239基因序列的5’UTR上游2000bp序列；通过无缝克隆组装扩增得到的各片段，获得WPRP载体，筛选，获得WPRP质粒；将WPRP质粒与转座辅助酶质粒pHelper混合，得质粒溶液；将质粒溶液注射入瓜实蝇白蛹品系的卵中，卵发育为成虫后，繁殖的后代化蛹时出现棕色蛹。采用本发明方法，可将瓜实蝇蛹色恢复作为筛选标记，仅需肉眼观察就能分辨出阳性转化子，极大提高了筛选效率。技术研发人员：林先武,范紫真,颜日辉,吴岩,查学宗受保护的技术使用者：海南大学技术研发日：技术公布日：2025/1/6