一种重组表达质粒、构建重组人源化胶原蛋白大肠杆菌的方法和透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法及其用途与流程

本发明属于多肽和基因工程，更具体地涉及重组表达质粒、构建重组人源化胶原蛋白大肠杆菌的方法和透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法及其用途。

背景技术：

1、胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。

2、生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。

3、中国专利发明201210482543.2公开了一种重组人源胶原蛋白以及其生产方法，其中公开了通过接头连接iii型胶原蛋白肽段并且在c端添加稳定序列获得的重组人源胶原蛋白。

4、中国专利发明201811438582.6的公开了多肽、其生产方法和用途，利用了基因工程技术，构建了一种能够制备多肽的工程菌，并通过该工程菌生产多肽，并通过tev蛋白酶酶切多肽的步骤最终制备多肽，即人源化胶原蛋白；

5、本发明是基于中国专利发明201811438582 .6的公开了多肽、其生产方法和用途的专利的进一步的改进，由于该发明需要另行添加tev蛋白酶进行酶切多肽的步骤最终制备多肽，即人源化胶原蛋白，转化效率低、反应周期长。

技术实现思路

1、为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种多肽及透皮型重组人源化胶原蛋白及其用途，通过因工程技术能够有效的解决另行添加tev蛋白酶进行酶切多肽的步骤最终制备多肽，即人源化胶原蛋白，转化效率低、反应周期长的问题。

2、本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：一种重组表达质粒，所述重组表达质粒的载体为pcoladuet-1，所述重组表达质粒包含：两段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸和用于表达并拆分两段编码重组型蛋白表达产物的双向启动子；

3、所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸，包括编码重组ii型人源胶原蛋白的聚核苷酸和编码重组iii型人源胶原蛋白的聚核苷酸；

4、所述重组iii型人源胶原蛋白的聚核苷酸为具有n个基本重复单元的核苷酸序列，基本重复单元为如seq no：1所示的核苷酸序列，n为大于等于6的整数，各重复序列之间是直接连接；

5、所述重组ii型人源胶原蛋白的聚核苷酸为具有m个基本重复单元的核苷酸序列，基本重复单元如seq no：2所示的核苷酸序列；m为2-3的整数，各重复序列之间是直接连接。

6、进一步地，所述双向启动子的核苷酸序列为如seq no：3所示的核苷酸序列；

7、进一步地，一种利用重组表达质粒，构建重组人源化胶原蛋白大肠杆菌的方法；

8、第1步：利用引物1和引物2将重组ii型人源胶原蛋白的聚核苷酸，正向连接到载体pcoladuet-1上，构建表达载体pcola-iolm；

9、第2步：利用引物3和引物4，将双向启动子的核苷酸序列，连接到表达载体pcola-iolm上，构建表达载体pcola-iolm-pla；

10、第3步：利用引物5和引物6，将重组iii型人源胶原蛋白的聚核苷酸，反向连接到表达载体pcola-iolm-pla上，构建表达载体pcola-iolm-pla-iolg；

11、第4步：将步骤3中构建的表达载体pcola-iolm-pla-iolg导入宿主细胞大肠杆菌中，得到重组人源化胶原蛋白大肠杆菌。

12、其中，引物1的dna序列为：seq no：4；所示的核苷酸序列为

13、3’-cgtcatatgaaaaacatcaccatcggaatgg-5’；

14、引物2的dna序列为：seq no：5；所示的核苷酸序列为

15、3’-gctggtacctcattaagcagatggaaccagcgcac-5’；

16、引物3的dna序列为：seq no：6；所示的核苷酸序列为

17、3’-gctggatccaggatgtctcagagaagtaagtac-5’；

18、引物4的dna序列为：seq no：7；所示的核苷酸序列为

19、3’-gcagtcgacttaggctattacatcgcgacgtttcc-5’。

20、引物5的dna序列为：seq no：8；所示的核苷酸序列为

21、3’-cgccatggtcatgactcttcgtatcgcccttttcg-5’；

22、引物6的dna序列为：seq no：9；所示的核苷酸序列为

23、3’-gctggatccttactaaacgttggcagggttgaggg-5’。

24、一种透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法，在生产培养基中培养所述重组人源化胶原蛋白大肠杆菌，

25、（1）挑取优选后的重组人源化胶原蛋白大肠杆菌单菌落，置于lb培养基中37℃培养过夜；

26、（2）将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入诱导剂进行诱导，20℃继续培养16小时，离心收集菌体；

27、（3）收获重组ii型人源胶原蛋白和重组iii型人源胶原蛋白；

28、（4）通过ni柱和/或阴离子交换层析纯化得到透皮型重组人源化胶原蛋白。

29、进一步地，所述诱导剂为半乳糖。

30、进一步地，所述透皮型重组人源化胶原蛋白具有透皮性能。

31、进一步地，所述透皮型重组人源化胶原蛋白用于化妆品或保健品

32、本发明的有益效果是：

33、本发明创造地制备一种重组表达质粒，并构建了重组人源化胶原蛋白大肠杆菌，在诱导剂诱导下，双向启动子引发重组iii型人源胶原蛋白的聚核苷酸和重组iii型人源胶原蛋白的聚核苷酸同时进行表达和拆分，避免了同向表达的干扰；并生产重组ii型人源胶原蛋白和重组iii型人源胶原蛋白，

34、本发明创造地制备透皮型重组人源化胶原蛋白，包含了拆分获得的重组ii型人源胶原蛋白和重组iii型人源胶原蛋白，具有优越的透皮效果；

35、本发明创造地制备透皮型重组人源化胶原蛋白，包含了拆分获得的重组ii型人源胶原蛋白和重组iii型人源胶原蛋白，重组ii型人源胶原蛋白和重组iii型人源胶原蛋白协同作用具有更为优越的胶原蛋白的再生能力。

技术特征：

1.一种透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于：在生产培养基中培养利用重组人源化胶原蛋白大肠杆菌制备，包括

2.根据权利要求1所述的透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述诱导剂为半乳糖。

3.根据权利要求1所述的透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述透皮型重组人源化胶原蛋白具有透皮性能。

4.根据权利要求1所述的透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述透皮型重组人源化胶原蛋白用于化妆品或保健品。

5.一种重组表达质粒，所述重组表达质粒的载体为pcoladuet-1，其特征在于用于构建权利要求1-4任意一项所述重组人源化胶原蛋白大肠杆菌，

6. 根据权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于所述双向启动子的核苷酸序列为如seq no：3所示的核苷酸序列。

7.一种构建重组人源化胶原蛋白大肠杆菌的方法；其特征在于：利用权利要求5的所述重组表达质粒，

8.根据权利要求7所述的构建重组人源化胶原蛋白大肠杆菌的方法，其特征在于所述

技术总结本发明公开了一种重组表达质粒、构建重组人源化胶原蛋白大肠杆菌的方法和透皮型重组人源化胶原蛋白的制备方法及其用途，属于多肽和基因工程技术领域，构建了重组人源化胶原蛋白大肠杆菌，在诱导剂诱导下，双向启动子引发重组III型人源胶原蛋白的聚核苷酸和重组III型人源胶原蛋白的聚核苷酸同时进行表达和拆分；并生产重组II型人源胶原蛋白和重组III型人源胶原蛋白，本发明的有益效果是：避免了同向表达的干扰；并生产重组II型人源胶原蛋白和重组III型人源胶原蛋白，重组II型人源胶原蛋白和重组III型人源胶原蛋白协同作用具有更为优越的胶原蛋白的再生能力和优越的透皮效果。技术研发人员：姜海超,孟祥瑞,王昌猛,杜秀丽,田慧敏受保护的技术使用者：山东义才和锐生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/6