氟乐灵半抗原、完全抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及食品安全检测，具体为氟乐灵半抗原、完全抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、氟乐灵(trifluralin)是一种重要的选择性芽前二硝基苯胺类(dinitroaniline)除草剂，广泛用于大豆、大麦、蔬菜及水果等作物，防除一年生禾本科杂草及部分阔叶杂草。氟乐灵虽属低毒农药，但长期暴露实验表明会对肝脏和肾脏造成损伤，在高剂量暴露下会造成胎儿的体重和身高偏低并增加流产风险。因氟乐灵农药的广泛使用，使其在土壤和水体当中的残留普遍存在，特别是能够在水产品(鱼、虾、蟹)体内富集，从而对水产品的食用安全带来巨大隐患。

2、为了避免氟乐灵除草剂的潜在危害，很多国家对其使用进行了限制。欧盟2015年对氟乐灵制定新的限量标准，水果、蔬菜、谷物及动物源食品中氟乐灵的最大残留限量(mrls)为0.01mg/kg。日本对进口水产品中氟乐灵最大残留限量为0.001mg/kg。目前农产品中氟乐灵的检测通常使用仪器分析的方法，如紫外光谱、高效液相色谱及液质联用、气相色谱、毛细管电泳等。以上的分析方法具有准确、灵敏的特点，但由于仪器昂贵、运行成本高难以全面推广。实践证明，以快速检测方法对大量样品进行初筛，然后对其中阳性样品进行仪器确证是提高检测效率、降低成本的有效方式，符合我国国情。在现有快速检测技术中，基于抗原-抗体特异性识别的免疫检测技术由于具有灵敏、快速、准确、成本低廉且可实现现场检测等优势，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技术。

3、关于氟乐灵免疫检测的文献国外仅有数篇报道。bruce riggle于1991年第一尝试构建了针对氟乐灵的酶联免疫分析方法，线性范围100～1000ppb(ng/ml)，同时可以检测部分氟乐灵的代谢物，但灵敏度较低。目前，国内未见有关氟乐灵免疫检测的相关报道。国内检测市场上更是缺少氟乐灵农药残留免疫检测试剂盒的产品。现在大部分药物、毒素、环境污染物分子质量比较小，属于半抗原，大部分半抗原需要与蛋白质偶联后才能产生免疫原性。目前制备半抗原抗体的常规方法是选择具有毒理学意义的原形药物作为待测物，通过设计合成保留待测物分子结构特征或类似结构特征并带有活性基团的半抗原，通过半抗原与大分子蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，同时经动物免疫制备针对半抗原的特异性抗体。而半抗原的提供是免疫化学分析中最为关键的步骤，合理的半抗原设计和制备将有利于抗体的质量的提高。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了氟乐灵半抗原、完全抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，从头合成了一种几乎保留氟乐灵完全结构同时又带有羧基的半抗原，进一步偶联不同载体蛋白分别作为人工免疫原和包被原，进而制备氟乐灵检测抗体，其具有灵敏度高，特异性好，可用于快速检测动物食品中残留的氟乐灵。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：氟乐灵半抗原，其特征在于，其结构式如下：

3、

4、进一步地，其合成路径如下：

5、

6、氟乐灵完全抗原，所述氟乐灵完全抗原为氟乐灵半抗原中的羧基与载体蛋白中氨基发生化学反应形成酰胺键连接的偶联物，所述氟乐灵完全抗原的结构式如下：

7、

8、所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。

9、氟乐灵人工抗原的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、合成氟乐灵半抗原；

11、s2、合成氟乐灵半抗原活化酯；

12、s3、利用氟乐灵半抗原活化酯进行透析获得氟乐灵人工抗原。

13、进一步地，所述s1具体包括以下步骤：

14、s11、配制a液：取4-氯-3,5-二硝基苯甲酸2.5g，用10ml的二氯甲烷溶解；

15、s12、取二正丙胺2.5g，加入反应瓶内并用二氯甲烷20ml进行稀释；

16、s13、控温条件下，将a液缓慢加入反应瓶，加料完毕，升温至40～45℃，反应6h。反应完毕，旋干二氯甲烷；

17、s14、加入20ml稀氢氧化钠溶液溶解产物，乙酸乙酯萃取2次，水层用1mol/l的盐酸调ph在4左右，将析出的黄色沉淀，过滤并烘干沉淀，获得氟乐灵半抗原。

18、进一步地，所述s2具体包括以下步骤：

19、s21、在5ml的玻璃瓶中，取氟乐灵半抗原24mg，用1ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解配制成b液；

20、s22、分别称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐24mg，n-羟基丁二酰亚胺14mg，两者混合一起用0.5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解配制成c液；

21、s23、冰浴条件下c液逐滴加入b液中，然后室温搅拌过夜。终止反应后即得半抗原活化酯。

22、进一步地，所述s3具体包括以下步骤：

23、s31、取半抗原活化酯4mg，加入到溶有8mg血蓝蛋白的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液中，在4度条件下反应过夜；

24、s32、将反应液装入透析袋，用0.01mol/l pbs溶液充分透析，得到免疫原；

25、s33、取半抗原活化酯12mg，加入到溶有100mgbsa的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液中，在4度条件下反应过夜；

26、s34、将反应液装入透析袋，用0.01mol/l pbs溶液充分透析，得到包被原。

27、氟乐灵抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

28、第一步、选取适龄雌性balb/c小鼠进行免疫，第4次免疫和第5次免疫后测定抗血清的效价和抑制率，在细胞融合前3天加强免疫；

29、第二步、取加强免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩大培养；

30、第三步、将扩大培养的杂交瘤细胞注入已提前注射石蜡的小鼠体内，收集腹水，得到单克隆抗体。

31、本发明提供上述氟乐灵抗体在检测氟乐灵残留物的应用。

32、本发明具有以下有益效果：

33、针对氟乐灵，从头合成了一种几乎保留氟乐灵完全结构同时又带有羧基的半抗原，进一步偶联不同载体蛋白分别作为人工免疫原和包被原，进而制备氟乐灵检测抗体，其具有灵敏度高，特异性好，可用于快速检测动物食品中残留的氟乐灵。

34、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

技术特征：

1.氟乐灵半抗原，其特征在于，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的氟乐灵半抗原，其特征在于，其合成路径如下：

3.氟乐灵完全抗原，其特征在于：所述氟乐灵完全抗原为权利要求1所述的氟乐灵半抗原中的羧基与载体蛋白中氨基发生化学反应形成酰胺键连接的偶联物，所述氟乐灵完全抗原的结构式如下：

4.氟乐灵人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的氟乐灵人工抗原的制备方法，其特征在于：所述s1具体包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的氟乐灵人工抗原的制备方法，其特征在于：所述s2具体包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的氟乐灵人工抗原的制备方法，其特征在于：所述s3具体包括以下步骤：

8.氟乐灵抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.一种权利要求8所述的氟乐灵抗体在检测氟乐灵残留物的应用。

技术总结本发明公开了氟乐灵半抗原、完全抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，涉及食品安全检测技术领域。本发明提供的针氟乐灵半抗原几乎保留氟乐灵完全结构，同时又带有可以牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白反应的与，可以进一步偶联不同载体蛋白分别作为人工免疫原和包被原，进而制备氟乐灵检测抗体，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，氟乐灵抗体具有灵敏度高，特异性好，可用于快速检测动物食品中残留的氟乐灵。技术研发人员：朱永利,蒋永青,王瑞,顾亚萍,潘剑蕾,张晓强,曾定玲受保护的技术使用者：深圳市绿诗源生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/6