一种半乳糖氧化酶突变体及其在制备2-氧代-2-呋喃基乙酸中应用

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种半乳糖氧化酶突变体及其在制备2-氧代-2-呋喃基乙酸中的应用。

背景技术：

1、呋喃铵盐，化学名称为(z)-2-甲氧亚氨基-2-呋喃基乙酸铵，是合成头孢呋辛的关键中间体，可由2-氧代-2-呋喃基乙酸与甲氧基胺进行肟化反应制得。

2、2-氧代-2-呋喃基乙酸作为合成呋喃铵盐的关键前体原料，目前主要通过化学方法制备，常见的路线为糠酸经过氯化制得呋喃甲酰氯，呋喃甲酰氯发生氰化反应，然后在酸性条件下水解制得2-氧代-2-呋喃基乙酸。但是该工艺会产生大量的有毒气体，操作危险，且三废处理困难。

3、近年来，由于生物酶法具有安全高效，成本低廉，立体选择性专一且对环境更加友好等优势，因此，生物酶法合成2-氧代-2-呋喃基乙酸工业成为主要研究方法，比如，专利cn116355974a中即报道了氧化酶可以催化2-呋喃基羟基甲基酮生成2-氧代-2-呋喃基乙酸，但是其并未披露具体的酶种及酶的生产工艺。

4、然而，目前已报道能够彻底氧化底物2-呋喃基羟基甲基酮生成氧化产物羧酸的氧化酶存在催化效率低、产物产量低等问题。

5、因此，若是能开发出一种催化能力更强的生物酶用于转化生产2-氧代-2-呋喃基乙酸，将极大的提高头孢呋辛工业化制备效率，对头孢呋辛市场的发展具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种半乳糖氧化酶突变体及其在制备2-氧代-2-呋喃基乙酸中的应用。

2、本发明开发了一种能够高效催化2-呋喃基羟基甲基酮反应制备2-氧代-2-呋喃基乙酸的半乳糖氧化酶突变体，此外，与该半乳糖氧化酶突变体对应的氨基酸序列、核苷酸序列、能够诱导表达该半乳糖氧化酶突变体的重组表达质粒、基因工程菌株及其制备方法同样是本发明保护的重点。

3、本发明所提供的一种半乳糖氧化酶突变体，所述的半乳糖氧化酶突变体是对半乳糖氧化酶seq id no:1所示的氨基酸序列（编码该半乳糖氧化酶的核苷酸序列，如seq idno:2所示）进行突变获得，所述半乳糖氧化酶突变体序列选择如下序列之一：

4、（1）将seq id no:1所示氨基酸序列的第193位丙氨酸替换为苏氨酸；

5、（2）将seq id no:1所示氨基酸序列的第195位谷氨酸替换为丝氨酸；

6、（3）将seq id no:1所示氨基酸序列的第290位色氨酸替换为苯丙氨酸；

7、（4）将seq id no:1所示氨基酸序列的第291位丝氨酸替换为丙氨酸；

8、（5）将seq id no:1所示氨基酸序列的第326位谷氨酰胺替换为天冬氨酸；

9、（6）将seq id no:1所示氨基酸序列的第406位苏氨酸替换为缬氨酸；

10、（7）包含上述（1）-（6）中至少两个位点的氨基酸残基的突变体。

11、其中，本发明所提供的催化效果最佳的半乳糖氧化酶突变体，其蛋白质的氨基酸序列为如seq id no:3所示的氨基酸序列，即将seq id no:1所示氨基酸序列的第193位丙氨酸替换为苏氨酸、第195位谷氨酸替换为丝氨酸、第290位色氨酸替换为苯丙氨酸、第291位丝氨酸替换为丙氨酸、第326位谷氨酰胺替换为天冬氨酸、第406位苏氨酸替换为缬氨酸。

12、编码上述半乳糖氧化酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no:4中所示。

13、此外，本发明还提供了上述的半乳糖氧化酶突变体的制备方法，包括如下步骤：半乳糖氧化酶编码基因定点突变，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。

14、进一步的，本发明利用分子克隆技术获得了突变体的编码基因，并通过构建突变体基因的6×his融合表达载体并导入基因工程菌 e.colibl21 (de3)中诱导表达，获得突变体酶蛋白，以突变体为催化剂、在适当的条件下进行酶催化反应转化制备的2-呋喃基羟基甲基酮。结果表明，本发明提供的突变体催化效率较半乳糖氧化酶fggoasem7-2a提高了46.4倍，合成2-氧代-2-呋喃基乙酸产率为104 mm，在2-氧代-2-呋喃基乙酸的工业生产中有巨大的应用潜力和价值。

15、本发明以上所提及的所有突变位点及任意组合突变编码半乳糖氧化酶突变体的基因，包括但不限于任何对上述所示氨基酸序列中氨基酸经过替换一个或几个氨基酸且对底物2-呋喃基羟基甲基酮有活性的，均为本发明所要重点保护的内容。此外，包含所述基因的表达盒﹑载体或者重组菌同样落入本发明所保护的技术范围中。

16、同理，包含了上述半乳糖氧化酶突变体的催化剂，同样是本发明所保护的技术内容。

17、更进一步地，本发明提供的上述半乳糖氧化酶突变体或包含了上述半乳糖氧化酶突变体的催化剂在以糠醛和甲醛为初始原料制备2-氧代-2-呋喃基乙酸中的应用，具体是以糠醛和甲醛为底物合成2-呋喃基羟基甲基酮，再以制备的2-呋喃基羟基甲基酮底物进行催化反应，合成2-氧代-2-呋喃基乙酸，同样是本发明所保护的技术内容。

18、所述的应用具体是：使用上述的半乳糖氧化酶突变体或包含了上述半乳糖氧化酶突变体的催化剂，以2-呋喃基羟基甲基酮为底物，在cu2+、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、磷酸缓冲液存在下，在反应温度20~30℃的条件下进行催化反应合成2-氧代-2-呋喃基乙酸。

19、本发明的有益效果在于：

20、（1）通过对半乳糖氧化酶fggoasem7-2a进行改造，获得了高活性的半乳糖氧化酶突变体fggoasem7-2a/a193t/e195s/w290f/s291a/q326d/t406v，催化效率在91.84~119.96 mm-1s-1的范围中，相较于半乳糖氧化酶fggoasem7-2a，半乳糖氧化酶突变体催化效率提升46.4倍；

21、（2）本发明中筛选得到的半乳糖氧化酶突变体在催化2-呋喃基羟基甲基酮制备2-氧代-2-呋喃基乙酸的反应中，具有良好的催化活性，产量高达104 mm，转化率为86.7%，实现了以糠醛和甲醛为初始原料生产2-氧代-2-呋喃基乙酸的高效催化，显著提高了2-氧代-2-呋喃基乙酸的生产效率。

技术特征：

1.一种半乳糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的半乳糖氧化酶突变体是对半乳糖氧化酶seq id no:1所示的氨基酸序列进行突变获得，所述半乳糖氧化酶突变体序列选择如下序列之一：

2.编码权利要求1所述的半乳糖氧化酶突变体的基因。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含编码权利要求1中所述的半乳糖氧化酶突变体氨基酸序列的核苷酸序列。

4.重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌是通过将权利要求3所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得的。

5.权利要求1所述的半乳糖氧化酶突变体或者权利要求4所述的重组工程菌在以2-呋喃基羟基甲基酮为底物，制备2-氧代-2-呋喃基乙酸中的应用。

6.制备2-氧代-2-呋喃基乙酸的方法，其特征在于，包括以下的步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，（2）中，所述的催化反应的反应条件为：在cu2+、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、磷酸缓冲液存在的条件下，于20~30℃进行反应。

技术总结本发明属于生物工程领域，具体涉及一种半乳糖氧化酶突变体及其在制备2‑氧代‑2‑呋喃基乙酸中应用。本发明对来自F.graminearum的半乳糖氧化酶进行酶的改造，获得了具有高活性的半乳糖氧化酶突变体。本发明筛选得到的半乳糖氧化酶突变体FgGOase<subgt;M7‑2A</subgt;/A193T/E195S/W290F/S291A/Q326D/T406V在催化2‑呋喃基羟基甲基酮在制备2‑氧代‑2‑呋喃基乙酸的反应中，具有良好的催化效率，催化效率在91.84~119.96 mM<supgt;‑1</supgt;S<supgt;‑1</supgt;的范围内，同时，在100 mL制备级反应中的转化率为86.7%，产量为104 mM。技术研发人员：马钦元,张同,魏浩,高秀珍,张紫嫣,陈良清,马志鑫受保护的技术使用者：山东理工大学技术研发日：技术公布日：2025/1/6