一种提高作物耐盐碱的β-氨基丁酸的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物化学，具体涉及一种提高作物耐盐碱的β-氨基丁酸的制备方法及其应用。

背景技术：

1、盐碱土壤是土壤盐渍化的一种，高盐高碱造成土壤板结，土壤结构变差，严重影响作物产量和质量。改良盐碱地的方式主要有水利措施改良，物理改良，化学改良，生物改良。但盐碱地土壤改良周期长，见效慢。制备能够提高作物对盐碱土的耐性，使作物在盐碱条件下能够正常生长的功能物质，是目前增加盐碱土壤作物栽培面积的有效手段。

2、β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid, baba）又名3-氨基丁酸，含有氨基、羧基两个官能团，其化学式为c4h9no2。β-氨基丁酸因官能团位置不同有两个同分异构体，分别为α-氨基丁酸（α-aminobutyric acid, aaba）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, gaba）。根据旋光性的不同，β-氨基丁酸还有r-β-氨基丁酸和s-β-氨基丁酸两种对映异构体。

3、β-氨基丁酸可以被植物吸收、转运并对植物产生保护作用，使植物获得防御性，对病毒、细菌等免疫，抵御卵母细胞、真菌、线虫、节肢动物，提高对一些非生物性刺激的耐受性，如缺水、高温、高盐等胁迫。

4、β-氨基丁酸的合成主要包括化学法和酶催化法。化学法是以甲醛为原料，经horner-wadsworth-emmons反应得到2-丁烯酸叔丁酯，后进一步利用巴豆酸甲酯合成（r）-3-氨基丁酸，以及在压力下利用氨水和丁烯酸反应合成β-氨基丁酸。但化学合成方法使用的金属或有机催化剂对环境不友好，在反应期间通常需要加保护剂，反应条件复杂。酶催化法合成β-氨基丁酸的重要合成酶是天冬氨酸酶，天冬氨酸酶具有确定的具体结构，不需要辅助因子，反应特异性高，酶活较高。

5、目前关于β-氨基丁酸的合成研究较少，亟需提供一种能够有效提高作物抗盐碱能力的β-氨基丁酸的制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种提高作物耐盐碱的β-氨基丁酸的制备方法。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种β-氨基丁酸的制备方法，包括：根据seq id no:l所示的氨基酸序列合成编码转氨酶的脱氧核糖核酸序列seq id no:2，使用连接酶将seq idno:2所示的序列与载体进行连接，构建重组载体，将重组载体导入到宿主菌中得到重组菌，培养，加入诱导剂，收集菌体，得到转氨酶。

4、具体地，所述的连接酶为t4 dna连接酶。

5、具体地，所述的载体选自pet28a、pezz18、pta1529、pub110、pe194、pmk3、ppic9、ppic9k、phil-s1中的一种或多种。

6、进一步地，所述的载体为pet28a。

7、具体地，所述的宿主菌为宿主大肠杆菌bl21。

8、具体地，所述的培养为将菌株接种于tb培养基中进行培养；

9、进一步地，所述培养的条件为35-38℃，180-220rpm；

10、再进一步地，所述培养的条件为37℃，200rpm。

11、具体地，所述的培养为将菌种培养至od600值为4.0。

12、具体地，所述的诱导剂为iptg；进一步地，所述的iptg的终浓度为0.1-1mm；

13、再进一步地，所述的iptg的终浓度为0.2-0.6mm。

14、具体地，所述的诱导条件为25-30℃，诱导10-14h；

15、进一步地，所述的诱导条件为28℃，诱导12h。

16、具体地，诱导后离心收集菌体，离心的条件为4℃，3000-5000rpm离心10-20min；

17、进一步地，所述离心的条件为4℃，4000rpm离心15min。

18、具体地，收集菌体后还包括用缓冲液重悬细胞的步骤；

19、进一步地，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的ph为6.0-8.0，浓度为40-60mm；

20、再进一步地，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.0，浓度为50mm。

21、具体地，所述β-氨基丁酸的制备方法，包括以巴豆酸作为底物，加入mgcl2和硫酸铵，调节ph，再加入转氨酶酶液进行反应，即得β-氨基丁酸。

22、进一步地，所述巴豆酸与转氨酶酶液的质量体积比为（1-3）：（2-5）；

23、再进一步地，所述巴豆酸与转氨酶酶液的质量体积比为2:3、3:5或1:2；

24、更进一步地，所述巴豆酸与转氨酶酶液的质量体积比为2:3。

25、进一步地，所述mgcl2的终浓度为0.5-1mm；再进一步地，所述mgcl2的终浓度为0.5mm。

26、进一步地，所述反应的温度为45-55℃；再进一步地，所述反应的温度为50℃。

27、进一步地，所述硫酸铵的终浓度为80-120mm；再进一步地，所述硫酸铵的终浓度为100mm。

28、进一步地，所述反应的ph为9.0-10.0；再进一步地，所述反应的ph为9.0。

29、又一方面，本发明提供了上述制备方法制备得到的β-氨基丁酸。

30、又一方面，本发明提供了上述β-氨基丁酸在改善作物耐盐碱胁迫能力中的应用。

31、具体地，所述的作物包括但不限于烟草、黄瓜、水稻、玉米、高粱、西瓜、大豆、棉花、花生、小麦。

32、进一步地，所述的作物为烟草或玉米。

33、本发明的有益效果为：

34、本发明提供了一种β-氨基丁酸的制备方法，制备得到的β-氨基丁酸能够提高作物的抗盐碱能力，提高盐碱胁迫植物中的相对含水量，并提高其脂质过氧化能力，增强作物中mda含量，能够有效缓解盐碱胁迫对植物生长的影响，提高作物种子的萌发率和发芽势。

技术特征：

1.一种β-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：根据seq id no:l所示的氨基酸序列合成编码转氨酶的脱氧核糖核酸序列seq id no:2，使用连接酶将seq id no:2所示的序列与载体进行连接，构建重组载体，将重组载体导入到宿主菌中得到重组菌，培养，加入诱导剂，收集菌体，得到转氨酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的β-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的巴豆酸与转氨酶酶液的质量体积比为（1-3）：（2-5）。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的巴豆酸与转氨酶酶液的质量体积比为2:3、3:5或1:2。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的mgcl2的终浓度为0.5-1mm。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的硫酸铵的终浓度为80-120mm。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应的ph为9.0-10.0。

8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的β-氨基丁酸。

9.权利要求8所述的β-氨基丁酸在改善作物耐盐碱胁迫能力中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的作物包括烟草、黄瓜、水稻、玉米、高粱、西瓜、大豆、棉花、花生和小麦。

技术总结本发明公开了一种提高作物耐盐碱的β‑氨基丁酸的制备方法及其应用，涉及生物化学技术领域。本发明提供了一种β‑氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：根据SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列合成编码转氨酶的脱氧核糖核酸序列SEQ ID NO:2，使用连接酶将SEQ ID NO:2所示的序列与载体进行连接，构建重组载体，将重组载体导入到宿主菌中得到重组菌，培养，加入诱导剂，收集菌体，得到转氨酶。本发明制备得到的β‑氨基丁酸能够提高作物的抗盐碱能力，提高盐碱胁迫植物中的相对含水量，并提高其脂质过氧化能力，能够有效缓解盐碱胁迫对植物生长的影响。技术研发人员：王雪颖,许孝瑞,王萌,姜振萃,王国锋,孙强生,孙明宾,于军受保护的技术使用者：烟台泓源生物肥料有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/6