一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒及其制备方法

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒及其制备方法。

背景技术：

1、脑胶质瘤(gbm)是指大脑和脊髓胶质细胞出现癌变所致的原发性颅脑肿瘤。在我国，脑胶质瘤每年的发病率高达5-8人/10万人。目前，对于新诊断的gbm患者，手术结合放疗和化疗是目前的治疗标准。然而，由于胶质瘤的浸润性强、肿瘤边界不清晰，肿瘤细胞在术中难以被彻底清除而易导致复发。同时，化疗和放疗产生的副作用较大，严重时可影响患者的日常生活。此外，由于大多数化疗药物的通透性较差，难以透过血脑屏障(bbb)在脑部富集。因此，设计安全有效地跨bbb的靶向递送系统是目前治疗gbm研究的重点。

2、姜黄素(cur)，一种姜科植物姜黄的根茎提取物，具有广泛的药理作用，能够抗炎、抗氧化、抗肿瘤。临床研究表明，cur单独或与其他药物合用，对癌症患者具有良好的抗癌效果，且几乎无不良反应。cur的抗癌作用具有多靶向性，它可以调节几乎所有类型的癌症状态，包括细胞增殖，癌症信号通路，转录因子，肿瘤血管生成。有研究表明cur能够通过以下分子机制作为治疗胶质母细胞瘤的潜在抗癌剂，包括抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖，诱导g2/m期发生停滞和凋亡，提高胶质母细胞瘤细胞中死亡关联蛋白激酶1的表达水平等，从而发挥抗癌作用。

3、由于肿瘤微环境的复杂性，单一的治疗策略难以有效地消除肿瘤，因此需要多种方法以克服单一治疗策略的缺陷。化学动力学疗法(cdt)是一种很有前途的癌症治疗模式，它是利用肿瘤内源性过表达的过氧化氢(h2o2)通过金属离子催化的芬顿/类芬顿反应产生毒性的羟基自由基(·oh)，从而诱导肿瘤细胞的凋亡或坏死。抗癌药物与具有cdt活性纳米材料结合，有望实现协同增强抗肿瘤作用。与fe2+介导的cdt相比，cu+催化的类芬顿反应在动力学和能量上都更有利，其催化活性比fe2+强160倍。当纳米粒子被癌细胞摄取后，金属离子会和肿瘤细胞中过表达的谷胱甘肽(gsh)和h2o2发生氧化还原反应。首先，gsh会将cu2+还原为cu+，同时生成氧化型的gsh(gssg)。然后，cu+和h2o2反应生成·oh，从而引起肿瘤细胞凋亡。

4、具有电荷翻转的核壳纳米粒子在提高靶向递送效率方面表现出独特的优势。虽然负电性的纳米粒可延长其在血液中的循环时间，但由于其表面本身的负电性不易被肿瘤细胞摄取，导致药物传输效率降低。正电性的纳米粒由于与肿瘤细胞的相互作用增强表现出高细胞摄取，但极易被内皮网状系统清除。因此，引入电荷翻转策略，通过构建负电荷的外壳，屏蔽正电荷的纳米粒内核，达到体内的长循环效果。同时，在肿瘤微环境的特定刺激(包括ph、酶等多种因素)下，负电荷的外壳可被瓦解，随后暴露出的正电荷纳米粒内核更易被肿瘤细胞摄取。

5、脑胶质瘤存在复杂的bbb系统，后续出现的epr效应也比外周肿瘤弱得多，仅靠单一的基于epr效应的被动靶向作用进行gbm的治疗是不足的。引入配体靶向策略有助于提高gbm的治疗效果，与单配体相比，双配体靶向具有更好的选择性。相比于正常的组织细胞，低密度脂蛋白受体相关蛋白1在bbb内皮细胞表面和肿瘤细胞上高度表达，唾液酸受体也在肿瘤细胞中存在着过表达的现象，可针对这两个受体设计双靶向配体修饰纳米粒子，为增加药物透过bbb到达肿瘤细胞，提高gbm的治疗效果提供更多的可能性。

技术实现思路

1、基于上述现有技术，本发明提供了一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒及其制备方法。本发明是以接枝咖啡酸(ca)的壳聚糖(cs)为骨架(cc)，选择cs中的氨基及ca中的邻苯二酚结构作为纳米粒配位的高亲和锚点，二价铜(cu(ii))作为配位桥梁和中间体，而姜黄素(cur)具有配位结合能力的二酮/烯醇部分，制备了一个基于配位驱动自组装的谷胱甘肽(gsh)响应药物递送系统(cc-cu-curnps)；选择苯硼酸(pba)接枝的γ-聚谷氨酸(γ-pga)(pp)为外壳屏蔽cc-cu-curnps的正电荷，带正电荷的内核cc-cu-curnps和带负电荷的外壳pp通过静电作用以及ph敏感的硼酸酯键相互结合形成γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒(pp/cc-cu-cur nps)；最后，利用静电相互作用在纳米粒表面吸附正电荷lf构建一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒(lf-pp/cc-cu-curnps)，该纳米粒可以透过bbb进一步靶向脑胶质瘤，同时具有ph/氧化还原双响应能力；lf-pp/cc-cu-.cur nps通过静脉注射给药进入血液循环后，通过乳铁蛋白(lf)的靶向作用透过bbb在脑区富集；pba可与肿瘤细胞表面过表达的唾液酸(sa)受体进一步结合，同时lf也可以和肿瘤细胞表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白1结合，使lf-pp/cc-cu-cur nps在脑胶质瘤内富集：具有ph响应性的硼酸酯键到达肿瘤微环境(ph 6.5)后断裂，阴离子外壳层pp脱除，暴露出正电荷的内核cc-cu-curnps，更易于被肿瘤细胞摄取；肿瘤细胞内高浓度的gsh竞争cu、ca和cur之间的配合位点，加速正电内核的瓦解，使cur和cu2+快速释放；一方面，释放的天然化合物cur直接发挥抗肿瘤疗效；另一方面，铜离子介导的类芬顿反应产生毒性的·oh，可诱导肿瘤细胞的凋亡。

2、本发明成功制备了一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒，制得的纳米粒分散均匀、粒径均一。

3、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒，特点是，所述γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒是以咖啡酸(ca)接枝的壳聚糖(cs)-铜-姜黄素(cur)配位驱动自组装形成的阳离子纳米粒为内核，苯硼酸(pba)修饰的γ-聚谷氨酸(γ-pga)作为阴离子外壳，通过静电作用以及ph敏感的硼酸酯键相互结合形成γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒；然后，乳铁蛋白(lf)通过静电吸附进一步修饰在纳米粒表面，构建了一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒。

5、进一步地，本发明所述的一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸，壳聚糖核壳纳米粒的制备方法，包括以下具体步骤：

6、(1)称取100mg cs，溶解于10ml的醋酸中(1％，v/v)，在室温搅拌下用适量甲醇稀释。取51mg ca溶解在适量甲醇中，并加入到cs溶液中；然后继续投入催化剂edc(81.2mg)和nhs(48.8mg)，通过与cs中的氨基反应形成酰胺键；将得到的反应混合物在室温下搅拌24h，用过量的水/甲醇混合物(1：4，v/v)透析2天，过0.8μm的微孔滤膜，然后冻干得到浅棕色的cc粉末备用；

7、(2)称取17.64mg γ-pga溶于适量dmso：h2o(1：1，v/v)中，溶解后投入催化剂edc(46mg)和nhs(27.6mg)，冰浴活化1h；之后缓慢滴加少量三乙胺，边滴边搅拌，直至调节最终溶液ph呈弱碱性；称取22.3mg pba溶于适量dmso：h2o(1：1，v/v)中，溶解完全后并将其逐滴滴加到上述y-pga溶液中，室温下反应24h，用纯水中透析2天，过0.8μm微孔滤膜，然后冻干得到白色海绵状的pp固体备用；

8、(3)在磁力搅拌下，将8.5ml cc(ph 6.5，1mg/ml)、0.5ml cucl2(10mm)、1ml cur(2mg/ml)混合，室温反应15min；随后，反应液40℃旋转蒸发除去乙醇并过0.8μm微孔滤膜，即得cc-cu-cur nps；

9、(4)在磁力搅拌下，将1ml的cc-cu-curnps滴入3ml浓度为10mg/ml的pp去离子水溶液中，在室温下继续搅拌3h，即得pp/cc-cu-cur nps；

10、(5)在磁力搅拌下，将1ml浓度为3mg/ml的lf滴入到5ml的pp/cc-cu-curnps体系中，室温下反应12h，即得lf-pp/cc-cu-cur nps。

11、本发明提供了一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒在制备脑胶质瘤产品中的应用。

12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

13、(1)本发明提供一种脑胶质瘤靶向的γ-聚谷氨酸/壳聚糖核壳纳米粒的制备方法，其大小适宜、粒径均一，可通过lf和pba的靶向作用透过bbb，在脑胶质瘤内富集；在肿瘤组织的酸性环境中硼酸酯键断裂，负电荷的外壳瓦解，暴露出正电荷的内核，从而被肿瘤组织更好的摄取；在肿瘤细胞高浓度的gsh下，gsh竞争cu、ca和cur之间的配合位点，加速正电内核的瓦解，使cur和cu2+快速释放；一方面，释放的天然化合物cur直接发挥抗肿瘤疗效；另一方面，铜离子介导的类芬顿反应产生毒性的·oh，可诱导肿瘤细胞的凋亡，效果相较于其他使用单一方法治疗脑胶质瘤的药物递送系统更加显著；

14、(2)本发明核壳纳米粒所用原料均无毒、无害且具有高度的生物相容性，例如cs作为一种天然的阳离子多糖被广泛用作药物载体，γ-pga是由d-和l-谷氨酸重复单元组成的阴离子聚多肽，cu是人体内许多天然酶的氧化还原辅助因子，而lf是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白。