一种高效缺血性损伤修复的hUCMSCs及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种高效缺血性损伤修复的hucmscs及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肢动脉缺血性疾病，涵盖下肢动脉硬化性闭塞症(aso)、血栓闭塞性脉管炎(tao)及糖尿病肢体动脉闭塞症(dlao)等多种病症，其临床表现多样，包括患肢乏力、间歇性跛行、静息痛、肌肉萎缩，严重时甚至出现溃疡、坏死乃至截肢的风险。这类疾病不仅给患者带来极大的痛苦，治疗过程漫长且复杂，还伴随着高致残率与死亡率，严重降低了患者的生活质量，并造成了沉重的经济与社会负担。当前，临床治疗主要依赖于动脉旁路移植和血管腔内技术，但这些方法受限于严格的适应症，且预后效果往往不尽人意，特别是对于年老体弱、无法耐受手术或腔内治疗效果不佳、面临截肢风险的患者，缺乏有效的治疗手段。因此，探索新的治疗方法与药物，以应对周围动脉闭塞症，成为临床上的迫切需求。

2、近年来，大量研究表明，间充质干细胞(ucmscs)的旁分泌机制在改善下肢缺血方面扮演着至关重要的角色。这些干细胞通过分泌一系列生物活性分子，如上皮生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维因子、血细胞生长因子、黏连蛋白及血管蛋白-1等，作用于特定的信号调节通路，激活并促进成纤维细胞和内皮细胞的迁移、增殖与分化，进而加速血管新生。这一过程能够显著增加缺血区域的血液供应，从而提升缺血性溃疡的愈合能力。此外，这些细胞因子还具备抑制伤口处炎症反应的功能，有助于加速伤口愈合进程。然而，常规的间充质干细胞(ucmscs)在应用中面临挑战，主要表现在其旁分泌的促血管生成因子及抗炎症反应因子含量较低，且对体内微环境的适应能力有限，这极大地限制了其治疗效果。

3、另一方面，氧气浓度作为影响细胞和微生物生长的关键因素，其调控对于细胞培养至关重要。例如，小鼠胚胎成纤维细胞在3％的低氧环境下培养，相较于20％的常规氧浓度，展现出更健康的生长状态，dna损伤减少，应激反应也更为轻微。在模拟急性炎症环境的实验中，tnf-α和il-1β作为缺血和损伤组织中高表达的炎性细胞因子，常被用于研究。然而，常规的间充质干细胞(如hucmscs，人脐带间充质干细胞等)由于旁分泌因子含量不足及对体内微环境适应性差，难以充分发挥其在组织缺血性损伤修复中的潜力。

4、综上所述，针对肢动脉缺血性疾病的治疗，亟需开发能够高效促进血管生成、抑制炎症反应，并适应体内复杂微环境的新型间充质干细胞疗法或相关药物，以满足临床需求，改善患者预后。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种高效缺血性损伤修复的hucmscs及其制备方法和应用。

2、第一方面，本发明提供了一种高效缺血性损伤修复的hucmscs的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

3、得到p2代hucmscs细胞；

4、于氧浓度体积分数范围1％-10％和添加有炎性因子预激活组合物的条件下，将所述p2代hucmscs细胞进行传代扩增培养，得到所述高效缺血性损伤修复的hucmscs；

5、其中，所述炎性因子预激活组合物包括以下组分：10-50ng/ml tnf-a、10-50ng/mlil-1β、0-20umol/llpa、10-100ng/ml hgf。

6、进一步地，得到p2代hucmscs细胞的步骤包括：从脐带组织中分离，贴壁培养法获得p2代hucmscs细胞。

7、进一步地，得到p2代hucmscs细胞的步骤包括以下过程：

8、步骤1：氏胶，剪碎并清洗，置于培养皿中备用；

9、步骤2：将处理后的组织块接种于培养瓶中，组织块间贴壁接种间隔距离1-2cm，于37℃、5.0％的co2条件下孵育；

10、步骤3：加入人间充质干细胞无血清培养基，接种标记hucmscs p0，定期观察细胞生长情况并换液；

11、步骤4：hucmscs p0细胞生长至融合度80％-90％，消化并收集p0代细胞，离心过滤去除组织块，得到p0代脐带间充质干细胞hucmscs p0；

12、步骤5：按1*10^6-2*10^6个/t75cm2瓶接种hucmscs p1，培养至融合度80％-90％后再次收集，传代培养和收集细胞，得到p2代hucmscs细胞。

13、进一步地，所述步骤4包括以下过程：培养12-15天，hucmscs p0细胞生长至融合度80％-90％，弃去上清培养液，加生理盐水3-5ml/瓶洗涤1-2次，用0.25％胰蛋白酶/edta消化液，0.5-1ml/瓶消化下爬出细胞及组织块，并用无血清胰蛋白酶终止液1-3ml/瓶终止消化；用50ml收集组织块及细胞悬液，1000-2000rpm离心5min,弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70-100μm滤网过滤去除组织块，即得到p0代脐带间充质干细胞hucmscs p0。

14、进一步地，所述步骤5包括以下过程：按1*10^6-2*10^6个/t75cm2瓶接种hucmscsp1，每瓶加入10-20ml人间充质干细胞无血清培养基，置于37℃ 5.0％ co2培养箱培养每2-4天待细胞融合率达到80％-90％时，重复步骤4收集hucmscs p1代细胞，细胞计数按1:3传代hucmscs p2，待细胞融合率达到80％-90％时，重复步骤4收集hucmscs p2代细胞。

15、进一步地，于氧浓度体积分数范围1％-10％和添加有炎性因子预激活组合物的条件下，将所述p2代hucmscs细胞进行传代扩增培养，得到所述高效缺血性损伤修复的hucmscs的步骤包括以下过程：

16、hucmscs-p2代细胞进行传代扩增培养，采用氧体积分数浓度范围额1％-10％的三气培养箱、20-30ml/t175cm2人间充质干细胞无血清培养基、炎性因子预激活组合物、按细胞计数按1:3传代hucmscs-p3，培养2-4天，待细胞融合率达到80％-90％时，重复步骤4收集hucmscs p3代细胞及其细胞上清液。

17、第二方面，本发明提供了一种高效缺血性损伤修复的hucmscs，所述高效缺血性损伤修复的hucmscs是采用第一方面任一项所述的制备方法制得。

18、进一步地，所述高效缺血性损伤修复的hucmscs分泌vegf蛋白水平为483.76±92.34pg/ml。

19、第三方面，本发明提供了一种第一方面和第二方面任一项所述的高效缺血性损伤修复的hucmscs在制备治疗肢动脉缺血性疾病药物中的应用。

20、本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：

21、本发明实施例提供了一种高效缺血性损伤修复的hucmscs及其制备方法和应用，本发明通过于氧浓度体积分数范围1％-10％和添加有炎性因子预激活组合物的特定条件下，将所述p2代hucmscs细胞进行传代扩增培养，使ucmscs在体外诱导培养阶段适应体内缺氧的病理微环境，诱导ucmscs对损伤微环境的记忆,保护ucmscs对抗不利的微环境，维持基因的稳定性。维持ucmscs的未分化状态,促进了ucmscs的增殖和存活,同时促进其旁分泌功能增强，如促血管生成因子vegf、hgf和碱性成纤维细胞生长因子bfgf、egf等的分泌增加，使其表现出更好的特性并具有更好的下肢缺血性损伤的修复效果，解决了现有hucmscs存在旁分泌的促血管生成和抑制炎症反应的细胞因子含量比较低，适应体内微环境能力差等问题，弥补了现有技术的不足。