一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素A中的应用的制作方法

本发明属于生物降解，具体涉及一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用。

背景技术：

1、赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是一类由部分曲霉菌和青霉菌分泌的霉菌毒素(mycotoxins)，常见于已霉变的饲料中。赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一种重要的污染食品的真菌毒素。包括结构类似的一系列化合物，其中以赭曲霉毒素a的分布最广、毒性最大，国际癌症机构已将其定为b类致癌物。目前报道的赭曲霉毒素主要存在于小麦、玉米、大米、饲料等中。近年来，赭曲霉毒素a的防控和解毒已引发科学界的广泛关注。现有的菌毒素理化脱毒技术存在特异性不强、资源浪费严重、环境不友好、安全风险高等缺陷，难以满足食品加工和保障粮食安全的实际需求。

2、cn103599619b公开了利用电子束辐照提高溶液中赭曲霉毒素a降解效果的方法，采用电子束辐照赭曲霉毒素a水溶液，溶剂水会辐解产生氧化性极强的·oh，还原性极强的水合电子和h·自由基，其中·oh自由基可以与赭曲霉毒素a的苯环和不饱和键发生加成反应，水合电子易攻击赭曲霉毒素a的cl元素，而使其脱卤；h·自由基在其脱氯后，迅速加成到基团上，致使赭曲霉毒素a降解。降解赭曲霉毒素a的方法有很多，包括物理方法、化学方法、生物方法等，但这些方法大多数降解不彻底、操作复杂、破坏营养成分等，使其在实际生产过程中受到限制。

3、生物脱毒因其成本低、安全高效等优势，近年来被认为是去除或控制赭曲霉毒素a污染最有前途的方法之一。微生物参与的生物催化过程因其反应条件温和、环境友好、可持续的优点近年来被广泛关注。cn113699062b公开了一株皮特不动杆菌，所述皮特不动杆菌以及其细胞内溶物对赭曲霉毒素a的降解率高，降解产物为赭曲霉毒素α(otα)和β-苯丙氨酸，毒性降低至少1000倍。然而基于微生物的解毒，存在引入微生物有毒代谢产物，由突变导致的活力下降，在粮食解毒过程中消耗粮食本身营养物质等诸多实际操作中的不可控因素。因此，筛选一种赭曲霉毒素a的特异性解毒酶，可进一步的改善这些问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用。本发明首次发现一种来源于lysobacter antibioticus的酰胺键水解酶具备降解赭曲霉毒素a的功能，所述酰胺键水解酶对赭曲霉毒素a的降解率在95.04％以上，可作为赭曲霉毒素a的解毒剂，在食品加工和保障粮食安全中具有重要应用价值。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用，所述酰胺键水解酶具有(i)、(ii)或(iii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

4、(i)如seq id no:1所示的氨基酸序列；

5、(ii)与seq id no:1所示的氨基酸序列具有≥90％同源性的氨基酸序列，且与(i)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列；

6、(iii)seq id no:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列。

7、优选地，所述酰胺键水解酶来源于lysobacter antibioticus。

8、优选地，所述酰胺键水解酶催化赭曲霉毒素a中的酰胺键断裂。

9、本发明首次发现一种来源于lysobacter antibioticus的酰胺键水解酶(氨基酸序列如seq id no:1所示)，长度433氨基酸，在实验条件下降解了95.04％的赭曲霉毒素a，展现了良好的降解效率。所述酰胺键水解酶催化赭曲霉毒素a降解为无毒性物质(如图1所示)，赭曲霉毒素a中含有酰胺键，是良好的水解位点，所述酰胺键水解酶水解赭曲霉毒素a的酰胺键生成已被报道毒性显著降低的赭曲霉毒素α和l-苯丙氨酸。

10、可以理解，本申请发现了来源于lysobacter antibioticus的酰胺键水解酶(氨基酸序列如seq id no:1所示)具备降解赭曲霉毒素a的功能，那么lysobacter antibioticus或相近菌株中的序列及功能与seq id no:1所示序列相同或相似的酶均能预期其具备降解赭曲霉毒素a的功能。此外，利用本领域通用技术手段对seq id no:1所示序列进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基改造而获得的酶，同时功能与原蛋白相同或相似，亦可预期其具备降解赭曲霉毒素a的功能。

11、优选地，所述酰胺键水解酶包括天然来源的或人工合成的。

12、优选地，所述天然来源的酰胺键水解酶为从lysobacter antibioticus的培养液中分离纯化得到的酰胺键水解酶。

13、优选地，所述人工合成的酰胺键水解酶为通过基因工程表达的酰胺键水解酶。

14、优选地，所述基因工程表达的酰胺键水解酶采用包括如下步骤的方法制备得到：

15、(1)合成编码酰胺键水解酶的核酸，将核酸序列连接到蛋白表达载体质粒得到反应模版质粒；

16、(2)将所述反应模版质粒加入到无细胞反应体系中，孵育后得到含有基因工程表达的酰胺键水解酶。

17、优选地，步骤(1)中，所述编码酰胺键水解酶的核酸包括seq id no:2所示的核苷酸序列。

18、优选地，步骤(1)中，所述蛋白表达载体质粒包括d2p表达质粒。

19、优选地，步骤(2)中，所述孵育的温度为35-37℃反应2.5-3.5h。

20、第二方面，本发明提供一种降解赭曲霉毒素a的方法，所述方法包括：将第一方面所述的酰胺键水解酶与含有赭曲霉毒素a的样品混合，实现降解赭曲霉毒素a。

21、第三方面，本发明提供第一方面所述的酰胺键水解酶在制备降解赭曲霉毒素a的产品中的应用。

22、第四方面，本发明提供一种赭曲霉毒素a生物降解剂，所述生物降解剂含有第一方面所述的酰胺键水解酶。

23、优选地，所述生物降解剂还包括载体、防腐剂或蛋白保护剂中的任意一种或至少两种的组合。

24、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

25、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

26、本发明首次发现一种来源于lysobacter antibioticus的酰胺键水解酶具备降解赭曲霉毒素a的功能，所述酰胺键水解酶对赭曲霉毒素a的降解率在95.04％以上，可作为赭曲霉毒素a的解毒剂，在食品加工和保障粮食安全中具有重要应用价值。

技术特征：

1.一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用，其特征在于，所述酰胺键水解酶具有(i)、(ii)或(iii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酰胺键水解酶来源于lysobacterantibioticus；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述天然来源的酰胺键水解酶为从lysobacter antibioticus的培养液中分离纯化得到的酰胺键水解酶。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人工合成的酰胺键水解酶为通过基因工程表达的酰胺键水解酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程表达的酰胺键水解酶采用包括如下步骤的方法制备得到：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述编码酰胺键水解酶的核酸包括seq id no:2所示的核苷酸序列；

7.一种降解赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-6中任一项所述的酰胺键水解酶与含有赭曲霉毒素a的样品混合，实现降解赭曲霉毒素a。

8.权利要求1-6中任一项所述的酰胺键水解酶在制备降解赭曲霉毒素a的产品中的应用。

9.一种赭曲霉毒素a生物降解剂，其特征在于，所述生物降解剂含有权利要求1-6中任一项所述的酰胺键水解酶。

10.根据权利要求9所述的赭曲霉毒素a生物降解剂，其特征在于，所述生物降解剂还包括载体、防腐剂或蛋白保护剂中的任意一种或至少两种的组合。

技术总结本发明提供一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素A中的应用，所述酰胺键水解酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：(I)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥90％同源性的氨基酸序列，且与(I)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列；(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列。本发明所述酰胺键水解酶具备降解赭曲霉毒素A的功能，降解率在95.04％以上，可作为赭曲霉毒素A的解毒剂，在食品加工和保障粮食安全中具有重要应用价值。技术研发人员：张大川,曹树民,邢华东,张昊阳受保护的技术使用者：上海知耕科技服务有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/11