具有B/C结构域交换的重组经典猪瘟病毒E2蛋白的制作方法

本发明涉及动物保健领域。具体地，本发明涉及重组经典猪瘟病毒(csfv)e2蛋白，其中包含限定csfv e2蛋白的6b8表位的至少一个氨基酸的片段被替换为来自除csfv外的瘟病毒的e2蛋白的相应片段。进一步地，本发明提供了包含本发明的重组e2蛋白的免疫原性组合物，以及该免疫原性组合物用于预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的用途。进一步地，本发明提供了重组csfv，优选减毒形式的重组csfv，其包含本发明的重组e2蛋白。此外，本发明提供了用于区分感染csfv的动物与用本发明的免疫原性组合物免疫接种的动物的方法和试剂盒。

背景技术：

1、经典猪瘟(csf)是猪和野猪的一种高度接触传染病，其造成重大的经济损失。该疾病的致病因子是经典猪瘟病毒(csfv)。在中国，实施了预防性疫苗接种和扑灭策略的组合来控制csf暴发。然而，在中国的大部分地区仍报道了散发性csf暴发和持续性感染。

2、本领域仍需要一种新的csfv疫苗，其是安全有效的，并且通过其免疫接种的动物可以与被野生型野毒株感染的动物区分开。

技术实现思路

1、在一个方面，本发明提供了重组csfv(经典猪瘟病毒)e2蛋白，其中包含限定csfve2蛋白的6b8表位的至少一个氨基酸的片段被替换为来自除csfv外的瘟病毒的e2蛋白的相应片段。

2、在一个方面，本发明提供了重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列中包含限定6b8表位的至少一个氨基酸的片段被替换为bvdv3 hobi样th/04khonkaen毒株的e2蛋白的相应片段。

3、在一个方面，本发明提供了重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列中csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸位置11至氨基酸位置109的序列被替换为bvdv3 hobi样th/04khonkaen毒株的e2蛋白的相应片段，并且氨基酸位置的编号基于通过seq id no:10显示的csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸序列的位置编号进行确定。

4、在一个方面，所述重组csfv e2蛋白进一步连接到免疫球蛋白fc片段，其中所述重组csfv e2蛋白中csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸位置11至氨基酸位置109的序列被替换为bvdv3 hobi样th/04khonkaen毒株的e2蛋白的相应片段。

5、在一个方面，所述重组csfv e2蛋白(包括连接到免疫球蛋白fc片段的重组csfve2蛋白)包含如说明书中进一步限定的、在csfv e2蛋白的氨基酸位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64处的进一步突变，其中所述重组csfv e2蛋白中csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸位置11至氨基酸位置109的序列被替换为bvdv3 hobi样th/04khonkaen毒株的e2蛋白的相应片段。在一个方面，本发明提供了编码本发明的重组csfv e2蛋白的重组核酸。

6、在一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。

7、在一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸或本发明的载体的宿主细胞。

8、在一个方面，本发明提供了用于生产本发明的重组csfv e2蛋白的方法，其包括(i)在适合于表达csfv e2蛋白的条件下，培养本发明的宿主细胞，并且(ii)分离并任选地纯化csfv e2蛋白。

9、在一个方面，本发明提供了包含本发明的重组csfv e2蛋白的重组csfv(经典猪瘟病毒)。

10、在一个方面，本发明提供了免疫原性组合物，其包含本发明的重组csfv e2蛋白、本发明的重组核酸、本发明的载体和/或本发明的重组csfv。

11、在一个方面，本发明提供了预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法，该方法包括将本发明的免疫原性组合物施用于有此需要的动物的步骤。

12、在一个方面，本发明提供了区分感染csfv的动物与用本发明的免疫原性组合物免疫接种的动物的方法，其包括a)获得样品，并且b)在免疫测试中测试所述样品。

13、在一个方面，本发明提供了用于区分感染csfv的动物与用本发明的免疫原性组合物免疫接种的动物的试剂盒，其包含特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体或其抗原结合片段。

14、在一个方面，本发明提供了用于在cho细胞中生产如本文所述的重组csfv e2蛋白的方法，所述方法包括a)使cho细胞适应培养基中的高密度悬浮培养；b)用包含编码本发明的重组csfv e2蛋白的核酸分子的哺乳动物表达载体，转染来自步骤a)的适应的cho细胞，c)在适合于表达重组csfv e2蛋白的条件下，培养来自步骤b)的转染的cho细胞；并且d)收获并任选地纯化重组csfv e2蛋白。

15、在一个方面，本发明提供了用于在cho细胞中生产如本文所述的重组csfv e2蛋白的方法，所述方法包括a)使cho细胞在培养基中生长；b)用包含编码本发明的重组csfv e2蛋白的核酸分子的哺乳动物表达载体，转染来自步骤a)的cho细胞，c)在适合于表达重组csfv e2蛋白的条件下，培养来自步骤b)的转染的cho细胞；并且d)收获并任选地纯化重组csfv e2蛋白。

技术特征：

1.一种重组csfv(经典猪瘟病毒)e2蛋白，其中包含限定csfv e2蛋白的6b8表位的至少一个氨基酸的片段被替换为来自除csfv外的瘟病毒的e2蛋白的相应片段。

2.根据权利要求1的重组csfv e2蛋白，其中所述替换导致重组csfv e2蛋白中的突变的6b8表位，6b8单克隆抗体或其抗原结合片段与所述突变的6b8表位的结合被特异性抑制。

3.根据权利要求1或2的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白源自来自毒株的野生型csfv e2蛋白，所述毒株选自c毒株、qz07、gd18和gd191。

4.根据权利要求1-3中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述野生型csfv e2蛋白包含选自seq id no:9-12的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述csfv e2蛋白的6b8表位被6b8单克隆抗体特异性识别和/或结合，所述6b8单克隆抗体

6.根据权利要求1-5中任一项的重组csfv e2蛋白，其中限定csfv e2蛋白的6b8表位的氨基酸至少包含在csfv e2蛋白的位置14、位置22、位置24、位置24/25、位置10、位置41和/或位置64处的氨基酸。

7.根据权利要求1-6中任一项的重组csfv e2蛋白，其中包含限定csfv e2蛋白的6b8表位的至少一个氨基酸的片段是csfv e2蛋白的b/c结构域或其片段。

8.根据权利要求1-7中任一项的重组csfv e2蛋白，其中

9.根据权利要求1-8中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述除csfv外的瘟病毒选自包含bvdv-2的牛病毒性腹泻病毒；包含switzerland、bdv-1、bdv-2、bdv-3、bdv-4、bdv-5、bdv-6、chamois、italy、turkey和突尼斯绵羊病毒(tsv)的边境病病毒；以及包含长颈鹿瘟病毒、bvdv-3、pronghorn antelope、bungowannah病毒和褐鼠瘟病毒的非典型瘟病毒。

10.根据权利要求9的重组csfv e2蛋白，其中所述除csfv外的瘟病毒选自长颈鹿瘟病毒pg2毒株、bdv-2reindeer v60、褐鼠瘟病毒分离株nrpv/nyc-d23、tsv9552、bungowannah6778和bvdv3 hobi样th/04khonkaen。

11.根据权利要求1-10中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述来自除csfv外的瘟病毒的e2蛋白包含选自seq id no:21-27的氨基酸序列。

12.根据权利要求1-11中任一项的重组csfv e2蛋白，其在限定csfv e2蛋白的6b8表位的氨基酸位置处包含特异性抑制6b8单克隆抗体与csfv e2蛋白的结合的至少一个氨基酸残基。

13.根据权利要求1-12中任一项的重组csfv e2蛋白，

14.根据权利要求1-13中任一项的重组csfv e2蛋白，其中在所述重组csfv e2蛋白的位置24处的氨基酸为r、d或i，其中r是优选的，在所述重组csfv e2蛋白的位置24和25处的氨基酸分别为r、d或i，其中r是优选的，以及d、k、l、n、r、t、v、e或p，其中d、k、l、n、r、t和v是优选的，在所述重组csfv e2蛋白的位置14处的氨基酸为k、a、e、q或r，其中k是优选的，并且在所述重组csfv e2蛋白的位置22处的氨基酸为a、r、q、e、d、n、k、l、p、t、v或s，其中a、q、d、e、n和s是优选的。

15.根据权利要求14的重组csfv e2蛋白，其中在所述重组csfv e2蛋白的位置24处的氨基酸为r，在所述重组csfv e2蛋白的位置25处的氨基酸为d，在所述重组csfv e2蛋白的位置14处的氨基酸为k，并且在所述重组csfv e2蛋白的位置22处的氨基酸为a。

16.根据权利要求1至15中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含选自seq id no:27-48和71-74的氨基酸序列。

17.根据权利要求1至16中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白与fc片段例如猪fc片段连接；优选地，所述e2蛋白的c末端与fc片段例如猪fc片段连接，优选经由肽接头连接。

18.根据权利要求17的重组csfv e2蛋白，其中所述fc片段包含seq id no:20的氨基酸序列。

19.根据权利要求17或18的重组csfv e2蛋白，其中所述肽接头包含选自seq id no:16-19的氨基酸序列。

20.根据权利要求17-19中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含选自seq id no:49-70和75-78；优选地选自seq id no:53、68和75；更优选地选自seq idno:53和75的氨基酸序列。

21.一种重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含csfv野毒株qz07的e2蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列中包含限定6b8表位的至少一个氨基酸的片段被替换为bvdv3 hobi样th/04khonkaen毒株的e2蛋白的相应片段。

22.根据权利要求21的重组csfv e2蛋白，

23.根据权利要求22的重组csfv e2蛋白，其中与bvdv3 hobi样th/04khonkaen毒株的e2蛋白的相应片段相比，所述重组csfv e2蛋白进一步包含在位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64处的至少一个氨基酸突变；优选地，所述重组csfv e2蛋白进一步包含在如表1-7中定义的氨基酸位置处的氨基酸突变；优选地，其中所述重组csfv e2蛋白进一步包含在重组csfv e2蛋白的位置14、24、25或64处的一个单一氨基酸突变。

24.根据权利要求23的重组csfv e2蛋白，其中

25.根据权利要求21-24中任一项的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白与fc片段例如猪fc片段连接；优选地，所述e2蛋白的c末端与fc片段例如猪fc片段连接，优选经由肽接头连接。

26.根据权利要求25的重组csfv e2蛋白，其中所述fc片段包含seq id no:20的氨基酸序列；和/或所述肽接头包含选自seq id no:16-19的氨基酸序列。

27.根据权利要求26的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含选自seq idno:96-101的氨基酸序列或由其组成；优选地，所述重组csfv e2蛋白包含seq id no:96所示的氨基酸序列或由其组成。

28.一种重组核酸，其编码根据权利要求1至27中任一项的重组csfv e2蛋白。

29.一种载体，其包含权利要求28的核酸。

30.一种宿主细胞，其包含权利要求28的核酸或权利要求29的载体，优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如cho细胞。

31.一种用于生产根据权利要求1-27中任一项的重组csfv e2蛋白的方法，其包括

32.一种重组csfv(经典猪瘟病毒)，其包含权利要求1-27中任一项的重组csfv e2蛋白。

33.权利要求32的重组csfv，其中所述重组csfv是减毒的。

34.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至27中任一项的重组csfv e2蛋白、根据权利要求28的重组核酸、根据权利要求29的载体、和/或权利要求32或33的重组csfv。

35.根据权利要求34的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗，例如标记物疫苗或diva(受感染的动物和免疫接种的动物之间的区分)疫苗。

36.根据权利要求34或35的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法中，所述方法包括将根据权利要求34或35的免疫原性组合物施用于有此需要的动物的步骤。

37.一种预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求34或35的免疫原性组合物施用于有此需要的动物的步骤。

38.一种区分感染csfv的动物与用权利要求34或35中任一项的免疫原性组合物免疫接种的动物的方法，其包括

39.根据权利要求38的方法，其中所述免疫测试包括测试特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体或其抗原结合片段是否可以与样品中的csfv e2蛋白结合。

40.根据权利要求38或39的方法，其中所述免疫测试包括测试特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体是否存在于样品中，和/或测试特异性识别重组csfv e2蛋白的突变的6b8表位的抗体是否存在于样品中。

41.根据权利要求38-40中任一项的方法，其中所述免疫测试是eia(酶免疫测定)或elisa(酶联免疫吸附测定)，优选双重竞争elisa。

42.根据权利要求39-41中任一项的方法，其中所述特异性识别6b8表位的抗体

43.一种用于区分感染csfv的动物与用权利要求34或35中任一项的免疫原性组合物免疫接种的动物的试剂盒，其包含特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体或其抗原结合片段。

44.一种用于在cho细胞中生产根据权利要求1至27中任一项的重组csfv e2蛋白的方法，所述方法包括

45.一种用于在cho细胞中生产根据权利要求1至27中任一项的重组csfv e2蛋白的方法，所述方法包括

46.权利要求44或45的方法，其中在步骤c)中，所述转染的cho细胞在约32-37℃，优选约32℃下进行培养。

47.权利要求44-46中任一项的方法，其中在步骤c)中，所述转染的cho细胞用约5-8％co2的湿润环境进行培养。

48.权利要求44-47中任一项的方法，其中所述重组csfv e2蛋白在转染后约2-14天，例如，转染后约4-12天，或转染后约8-10天进行收获。

技术总结本发明涉及动物保健领域。具体地，本发明涉及重组经典猪瘟病毒E2蛋白，其中包含限定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一个氨基酸的片段被替换为来自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相应片段。进一步地，本发明提供了包含本发明的重组E2蛋白的免疫原性组合物，以及该免疫原性组合物用于预防和/或治疗动物中与CSFV相关的疾病的用途。此外，本发明提供了用于区分感染CSFV的动物与用本发明的免疫原性组合物免疫接种的动物的方法和试剂盒。技术研发人员：陈宁,刘欢欢,王佳莹,童超受保护的技术使用者：勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13