抗体的新型组合及其用途的制作方法

本发明涉及一种组合，其包含：(i)能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及(ii)与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子，其中该组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。本发明还涉及所述组合在制造用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，以及一种用于治疗患者的癌症的方法，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，该方法包括施用所述组合。

背景技术：

1、用免疫检查点阻断抗体治疗已经改变了患有晚期实体癌(包括转移性黑素瘤、非小细胞肺癌和错配修复缺陷型癌症)的患者的生存率(hodi等人，2010；larkin等人，2015；topalian等人，2012)。

2、然而，由于许多患者未能响应免疫检查点阻断(icb)或获得对icb的抗性，因此仍存在大量尚未满足的需求(sharma等人，2017)。据信，缺乏疗效的原因包括肿瘤浸润性免疫细胞(til)缺乏或不足，在til中最显著的是cd8+ t细胞(chen和mellman，2013；gajewski等人，2013)。实体癌肿瘤微环境(tme)中缺乏趋化信号和炎症信号同样被认为是car-t细胞疗法耐药性的基础(wagner等人，2020)。

3、因此，非常需要鉴定诱导炎性免疫细胞募集到“免疫遗弃”或“免疫排斥”肿瘤中，从而转化为稳健的全身适应性抗肿瘤免疫和cd8+ t细胞浸润，同时使原发性肿瘤和转移性肿瘤消退的治疗剂。

4、瘤内(i.t.)溶瘤病毒疗法诱导t细胞浸润并改善抗pd-1免疫疗法(ribas等人，2017)。与单一药剂icb相比，使用抗ctla-4抗体和抗pd-1抗体的组合疗法增强了疗效，这可能是通过互补机制即系统性cd4+和cd8+ t细胞分化以及t效应细胞和调节性t细胞的肿瘤局部调节实现的(arce vargas等人，2018；wei等人，2019)。然而，全身性施用抗ctla-4(包括已批准的伊匹木单抗)的耐受性问题限制了临床应用(postow等人，2015)。

5、全身性抗ctla-4抗体疗法的疗效和耐受性似乎有关联。增加伊匹木单抗剂量既提高了疗效，也增强了副作用(bertrand等人，2015)。与ctla-4的中枢免疫检查点功能一致，副作用可能很严重，而且具有全身性自体免疫性质(tivol等人，1995)。

6、有趣的是，最近报道，相对于cd8+和cd4+效应t细胞耗竭过度表达ctla-4的瘤内(“i.t.”)treg细胞，有助于伊匹木单抗的治疗活性，并且treg耗竭增强的抗ctla-4抗体变体在携带肿瘤的fcγr-人源化小鼠中显示出改善的治疗活性(arce vargas等人，2018)。这些发现表明，与目前可用的抗ctla-4疗法相比，使用耗竭treg的抗ctla-4抗体的肿瘤局部疗法可以提供强大的治疗活性，同时副作用减少(marabelle等人，2013a；marabelle等人，2013b)-特别是在与经验证的安全免疫调节剂如pd-1/pd-l1轴阻断剂或溶瘤病毒联合使用时。

技术实现思路

1、在此背景下，发明人在本文中描述并表征了掺入全长人重组抗ctla-4抗体的基于痘苗病毒(vv)的溶瘤载体。发明人还描述了编码最近发现的全长人重组抗ctla-4抗体的溶瘤病毒。这种病毒编码的新型人igg1ctla-4抗体(命名为“4-e03”)是使用功能优先筛选单克隆抗体(“mab”)和与优异的treg耗竭活性相关联的靶标来鉴定的。在以人瘤内相关ctla-4表达为特征的人源化小鼠模型中，4-e03 igg1证明与经临床验证的伊匹木单抗相比，增强了treg耗竭。相比之下，与伊匹木单抗相比，4-e03在阻断ctla-4:b7相互作用与克服ctla-4介导的效应t细胞增殖抑制方面显示出类似的效力。在本发明中，肿瘤选择性溶瘤痘苗载体经工程改造以编码这种新型的强烈耗竭treg且阻断检查点的抗ctla-4抗体4-e03和gm-csf(vvgm-ahctla4，bt-001)。另外生成了编码匹配的treg耗竭小鼠替代抗体的病毒，使得能够在代表发炎或免疫排斥肿瘤微环境、对icb敏感或耐药的同基因免疫感受态小鼠肿瘤模型中进行概念验证研究。

2、这导致了意外的发现，即，表达抗ctla-4抗体的溶瘤病毒与抗pd-1/pd-l1抗体协同排斥“冷肿瘤”(在本文中也称为“冷免疫肿瘤”)。这是令人惊奇的，因为已知冷肿瘤对全身性静脉内单一药物或者icb与目前可用的抗ctla-4和/或抗pd-1的组合具有耐药性，本文所公开的“冷肿瘤”小鼠模型中的动物也是如此。

3、如在“实施例”和本文中所讨论的，“冷”肿瘤是t细胞浸润不良的肿瘤。令人惊奇的是，发明人已发现，使用表达抗ctla-4抗体和抗pd-1/pd-l1抗体的溶瘤病毒进行的联合治疗诱导t细胞大量涌入“冷”肿瘤中，这些肿瘤变得与“热”肿瘤一样密集地富含t细胞。

4、发明人的惊人发现为治疗包括“冷”肿瘤或由“冷”肿瘤组成的癌症提供了进一步的有益治疗方法。如本文所述，本发明整体涉及一种组合，其包含：(i)能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及(ii)与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子，其中该组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

5、在第一方面，本发明提供了一种组合，其包含：

6、-能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及

7、-与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子；

8、该组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

9、在第二方面，本发明提供了以下物质即：

10、-能够表达编码与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的核苷酸序列的溶瘤病毒；以及

11、-与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子；

12、在制造用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

13、在第三方面，本发明提供了一种用于治疗患者的癌症的方法，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，该方法包括向患者施用：

14、-能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及

15、-与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子。

16、在第四方面，本发明提供了一种能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒，其与特异性地结合到pd-1和/或pd-l1的第二抗体分子结合使用；用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

17、如上文所讨论和在所附实施例中所证实的，在本发明的上述方面中，用能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子和与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体的溶瘤病毒治疗使得t细胞涌入患者的癌症的冷肿瘤中。这导致患者的癌症的冷肿瘤中t细胞的数量和/或密度增加，使得冷肿瘤变得与热肿瘤类似地密集富含t细胞。在本发明的一个实施方案中，患者的癌症的冷肿瘤中t细胞的数量和/或密度增加约5倍至25倍或更多倍，例如增加约5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或11倍、或12倍、或13倍、或14倍、或15倍、或16倍、或17倍、或18倍、或19倍、或20倍、或21倍、或22倍、或23倍、或24倍、或25倍，或更多倍。

18、因此，在另一方面，本发明提供了一种组合，其包含：

19、-能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及

20、-与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子；

21、该组合用于增加患者的癌症的冷肿瘤中t细胞的数量和/或密度，并且/或者介导t细胞涌入患者的癌症的冷肿瘤中。应当理解，通过这样做，本发明治疗患者的癌症。在本发明的一个实施方案中，患者的癌症的冷肿瘤中t细胞的数量和/或密度增加约5倍至25倍或更多倍，例如增加约5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或11倍、或12倍、或13倍、或14倍、或15倍、或16倍、或17倍、或18倍、或19倍、或20倍、或21倍、或22倍、或23倍、或24倍、或25倍，或更多倍。

22、如本文所讨论的，本发明的溶瘤病毒能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子。细胞毒性t淋巴细胞相关抗原(ctla-4或ctla4)，也称为cd152，是阻断t细胞激活的b7/cd28家族成员。ctla-4在激活的t细胞上表达，并向t细胞传递抑制信号。它与t细胞共刺激蛋白cd28同源，并且ctla-4和cd28都与cd80(也称为b7-1)和cd86(也称为b7-2)结合。ctla4还存在于调节性t细胞(regulatory t cell，treg)中，并有助于其抑制功能。ctla-4蛋白含有胞外v结构域、跨膜结构域和胞质尾区。

23、已经提出，结合ctla-4的抗体通过双重机制发挥其治疗活性，既作用于免疫效应cd4+和cd8+ t细胞，又作用于免疫抑制性t调节(treg)细胞。在效应t细胞上，阻断ctla-4与其配体b7.1和b7.2的相互作用的ctla-4抗体可以增强免疫应答，并且已被证明能够刺激强效的抗肿瘤免疫(korman等人，2006,checkpoint blockade in cancer immunotherapy,adv immunol.90:297-339)。

24、最近，证实fc效应子功能和treg耗竭有助于抗ctla-4抗体(包括临床相关抗体伊匹木单抗和曲美木单抗)的治疗活性并与之相关联(arce vargas、furness等人，2018)。疗效和毒性(后者可能很严重，并且具有自体免疫性质)被认为与目前可用的全身抗ctla-4方案相关。因此，一直缺乏递送高效而安全的基于抗ctla-4的icb的方法。发明人最近证明，瘤内递送的编码treg耗竭抗ctla-4抗体的溶瘤病毒(i.t.载体化抗ctla-4)具有广泛的抗肿瘤活性。在本文中，发明人出乎意料地证明，在pd-1/pd-l1 icb的情况下，i.t.载体化抗ctla-4对免疫浸润不良的“冷”肿瘤具有疗效，这种“冷”肿瘤对全身性抗体介导的icb有耐药性。另外，由于与该方法相关联的肿瘤限制性抗ctla-4暴露，表明与批准的抗ctla-4方案相比，i.t.载体化抗ctla-4既安全又耐受良好。

25、如本文所讨论的，本发明还涉及与pd-1特异性结合并且/或者与pd-l1特异性结合的第二抗体分子。在一些实施方案中，第二抗体分子与pd-1特异性结合；在一些实施方案中，第二抗体分子与pd-l1特异性结合；并且在一些实施方案中，第二抗体分子与pd-1和pd-l1两者特异性结合。

26、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1或pd1)，也称为cd279，存在于t细胞和b细胞的表面上并且抑制t细胞活性。pd-1结合两个配体：pd-l1和pd-l2。程序性死亡配体1(pd-l1)，也称为cd274，与其受体pd-1结合产生抑制信号，该抑制信号减少t细胞增殖。

27、抗体是免疫学和分子生物学领域的技术人员众所周知的。通常，抗体包含两条重(h)链和两条轻(l)链。在本文中，我们有时将这种完整抗体分子称为全尺寸或全长抗体。抗体的重链包含一个可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)，抗体分子的轻链包含一个可变结构域(vl)和一个恒定结构域(cl)。可变结构域(有时统称为fv区)与抗体的靶标或抗原结合。每个可变结构域包含三个环，这些环被称为互补决定区(cdr)，负责靶标结合。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能。根据抗体或免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可以被分配到不同类别。有五种主要免疫球蛋白类别：iga、igd、ige、igg和igm，并且在人体中，这些类别中的几个类别被进一步划分为亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3和igg4；iga1和iga2。抗体的另一部分为fc结构域(也称为片段可结晶结构域)，其包括每个抗体重链的恒定结构域中的两个恒定结构域。fc结构域负责抗体与fc受体之间的相互作用。

28、fc受体是膜蛋白，其通常发现于免疫系统细胞的细胞表面上(即，fc受体发现于靶细胞膜–也被称为质膜或细胞质膜上)。fc受体的作用是通过fc结构域结合抗体，并将抗体内化到细胞中。在免疫系统中，这可能导致抗体介导的吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。

29、fc受体的亚组是对igg抗体具有特异性的fcγ受体(fcγ受体，fcγr)。存在两种类型的fcγ受体：活化fcγ受体(也表示为活化性fcγ受体)和抑制性fcγ受体。活化受体和抑制性受体分别经由基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)或基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(itim)传输其信号。在人类中，fcγriib(cd32b)是抑制性fcγ受体，而fcγri(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriic(cd32c)、fcγriiia(cd16a)和fcγriv是活化fcγ受体。fcγriiib是在中性粒细胞上表达的gpi连接的受体，该gpi连接的受体缺乏itam基序，但通过其交联脂质筏并与其他受体接合的能力，而也被视为活化性受体。在小鼠中，活化受体是fcγri、fcγriii和fcγriv。

30、众所周知，抗体通过与fcγ受体的相互作用来调节免疫细胞活性。具体地，抗体免疫复合物如何调节免疫细胞活化是通过其活化fcγ受体和抑制性fcγ受体的相对接合来确定的。不同抗体同种型以不同亲和力与活化fcγ受体和抑制性fcγ受体结合，从而产生不同的a:i比率(活化:抑制比率)(nimmerjahn等人，science.2005年12月2日；310(5753):1510-2)。

31、通过与抑制性fcγ受体结合，抗体可以抑制、阻断和/或下调效应细胞功能。

32、通过与活化性fcγ受体结合，抗体可以活化效应细胞功能并且由此触发以下机制，诸如抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、细胞因子释放和/或抗体依赖性内吞，以及在中性粒细胞的情况下的netosis(即net(中性粒细胞胞外陷阱)的活化和释放)。抗体与活化fcγ受体的结合还可能导致某些活化标志物(诸如cd40、mhcii、cd38、cd80和/或cd86)增加。

33、在一些实施方案中，与ctla-4特异性结合的抗体分子是fcγ受体接合抗体。所谓“fcγ受体接合抗体”，意指该抗体分子可以经由其fc区与至少一种fcγ受体结合。

34、如本文所用，术语“抗体分子”涵盖全长或全尺寸抗体，以及全长抗体的功能性片段和这类抗体分子的衍生物。

35、全尺寸抗体的功能性片段具有与对应的全尺寸抗体相同的抗原结合特征，并且包括与对应的全尺寸抗体相同的可变结构域(即，vh序列和vl序列)和/或相同的cdr序列。功能性片段具有与对应的全尺寸抗体相同的抗原结合特征，意味着该功能性片段与全尺寸抗体结合到靶标上的相同表位。这样的功能性片段可以对应于全尺寸抗体的fv部分。替代性地，这种片段可以是fab，也表示为单价抗原结合片段fab'或二价抗原结合片段(fab')2，其中该单价抗原结合片段不含有fc部分，该二价抗原结合片段含有通过二硫键或fab'(即(fab')2的单价变体)连接在一起的两个抗原结合fab部分。这种片段也可以是单链可变片段(scfv)。

36、在一些实施方案中，本文所述的第一抗体分子和/或第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，fab、fv、scfv、fab'和(fab')2)组成的组。

37、功能性片段并不总是含有对应全尺寸抗体的所有六个cdr。应当理解，含有三个或更少cdr区(在一些情况下，甚至仅单个cdr或其一部分)的分子能够保留该cdr的来源抗体的抗原结合活性。例如，在gao等人，1994,j.biol.chem.,269:32389-93中，描述了整条vl链(包含所有三个cdr)对其底物具有高亲和力。

38、含有两个cdr区的分子描述于例如以下文献中：vaughan和sollazzo，2001,combinatorial chemistry&high throughput screening,4:417-430.第418页(右栏–3ourstrategy for design)，描述了仅包含散布在框架区内的h1和h2 cdr高变区的微抗体。所述微抗体被描述为能够与靶标结合。pessi等人，1993,nature,362:367-9和bianchi等人，1994,j.mol.biol.,236:649-59被vaughan和sollazzo引用，其中更详细地描述了h1和h2微抗体及其性质。在qiu等人,2007,《自然生物技术(nature biotechnology)》,25:921-9中，表明由两个连接的cdr组成的分子能够结合抗原。quiocho1993,《自然》,362:293-4提供了“微抗体”技术的总结。ladner 2007,《自然生物技术》,25:875-7指出，含有两个cdr的分子能够保留抗原结合活性。

39、含有单个cdr区的抗体分子描述于例如以下文献中：laune等人，1997,jbc,272:30937-44，其中证明源自cdr的一系列六肽显示出抗原结合活性，并且注意到完整的单个cdr的合成肽显示出强结合活性。在monnet等人,1999,《生物化学杂志》,274:3789-96中，示出了一系列12聚体肽和相关框架区具有抗原结合活性，并且指出仅cdr3样肽能够结合抗原。在heap等人，2005,j.gen.virol.,86:1791-1800中，报道了“微抗体”(含有单个cdr的分子)能够结合抗原，并且示出来自抗hiv抗体的环状肽具有抗原结合活性和功能。在nicaise等人,2004,《蛋白质科学(protein science)》,13:1882-91中，示出了单个cdr可以赋予抗原结合活性和对其溶菌酶抗原的亲和力。

40、因此，具有五个、四个、三个或更少的cdr的抗体分子能够保留其来源全长抗体的抗原结合性质。

41、抗体分子也可以是全长抗体的衍生物或这种抗体的片段。衍生物具有与对应的全尺寸抗体相同的抗原结合特性，因为该衍生物与全尺寸抗体结合到靶标上的相同表位。

42、因此，如本文所用，所谓术语“抗体分子”，包括所有类型的抗体分子及其功性能片段及其衍生物，包括：单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、可变片段(fv)、包括二价单链可变片段(di-scfv)和二硫键连接的可变片段的单链可变片段(scfv片段)、fab片段、f(ab')2片段、fab'片段、抗体重链、抗体轻链、抗体重链的同二聚体、抗体轻链的同二聚体、抗体重链的异二聚体、抗体轻链的异二聚体、这类同二聚体和异二聚体的抗原结合功能性片段。

43、另外，如本文所用，术语“抗体分子”包括所有类别的抗体分子和功能性片段，包括：igg、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、igd和ige。

44、在一些实施方案中，抗体是人igg1。技术人员了解，小鼠igg2a和人igg1与激活性fcγ受体有效地结合并且能够通过用例如adcp和adcc激活带有免疫细胞(例如巨噬细胞和nk细胞)的激活性fcγ受体来激活靶细胞的缺失。因此，尽管小鼠igg2a是针对小鼠中的缺失的优选同种型，但是人igg1是针对人中的缺失的优选同种型。相反地，对已知tnfr超家族激动剂受体(例如4-1bb、ox40、tnfrii、cd40)的最佳共刺激取决于抗体接合抑制性fcγriib。在小鼠中，已知优先结合抑制性fcγ受体(fcγriib)且仅与激活性fcγ受体弱结合的igg1同种型是针对tnfr超家族靶向性mab的共刺激活性的最佳选择。虽然未描述过小鼠igg1同种型在人体内的直接等效物，但是抗体可以经工程改造以示出类似增强的与抑制性人fcγ受体的结合，该结合优于与活化性人fcγ受体的结合。在被工程改造为表达人激活性fcγ受体和人抑制性fcγ受体的转基因小鼠中，这类经过工程改造的tnfr超家族靶向性抗体在体内的共刺激活性也得到了改善(1}dahan等人,2016,《激动性人抗cd40单克隆抗体的治疗活性需要选择性的fcγr参与(therapeutic activity of agonistic,human anti-cd40monoclonal antibodies requires selective fcγr engagement.)》cancercell.29(6):820-31)。

45、如上所概述的，抗体分子的不同类型和形式包含在本发明中，而且是免疫学领域技术人员已知的。众所周知的是，用于治疗目的的抗体通常用改进抗体分子性质的附加组分来修饰。

46、因此，我们提出：本发明的抗体分子或根据本发明使用的抗体分子(例如，单克隆抗体分子和/或多克隆抗体分子和/或双特异性抗体分子)包含可检测部分和/或细胞毒性部分。

47、所谓“可检测部分”，包括一种或多种来自包括以下项的组的组成部分：酶、放射性原子、荧光部分、化学发光部分、生物发光部分。可检测部分允许抗体分子在体外和/或体内和/或离体可见。

48、所谓“细胞毒性部分”，包括放射性部分和/或酶，例如，其中酶是半胱天冬酶和/或毒素，例如，其中毒素是细菌毒素或毒液；其中细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。

49、我们还提出，抗体分子可以呈分离形式和/或经纯化形式，并且/或者可以是聚乙二醇化抗体分子。

50、如上文所讨论的，抗体的cdr与抗体靶标结合。将氨基酸分配给本文所述每个cdr是根据以下文献中提出的定义进行的：kabat ea等人，1991,“sequences of proteins ofimmunological interest”，第5版，nih出版号91-3242，第xv至第xvii页。

51、如技术人员将了解的，还存在用于向每个cdr分配氨基酸的其他方法。例如，国际免疫遗传学信息系统(imgt(r))(http://www.imgt.org/and lefranc and lefranc“theimmunoglobulin factsbook”，由academic press出版，2001)。

52、在另一个实施方案中，本发明或根据本发明使用的ctla-4特异性抗体分子是能够与本文所述特异性抗体竞争的抗体分子，诸如具有seqid.no:15、16、17、10、18和19或seqid.no:22、23、24、10、25和26的抗体分子。

53、所谓“能够竞争”，意指竞争性抗体能够至少部分地抑制或以其他方式干扰如本文所定义的抗体分子与特异性靶标的结合。

54、例如，这种竞争性抗体分子可以能够将本文所述抗体分子的结合至少抑制约10％；例如，至少抑制约20％，或至少抑制约30％，至少抑制约40％、至少抑制约50％、至少抑制约60％、至少抑制约70％、至少抑制约80％、至少抑制约90％、至少抑制约95％、至少抑制约100％，并且/或者将本文所述抗体防止或减少与特异性靶标结合的能力至少抑制约10％；例如，至少抑制约20％、至少抑制约30％、至少抑制约40％、至少抑制约50％、至少抑制约60％、至少抑制约70％、至少抑制约80％、至少抑制约90％、至少抑制约95％，或至少抑制约100％。

55、可以通过本领域技术人员众所周知的方法来确定竞争性结合，诸如酶联免疫吸附测定(elisa)。

56、可以使用elisa测定来评价表位修饰或阻断抗体。适用于鉴定竞争性抗体的附加方法公开于antibodies:a laboratory manual,harlow和lane中，该文献以引用方式并入本文(例如，参见第567页到第569页、第574页到第576页、第583页以及第590到第612页，1988，cshl,ny,isbn 0-87969-314-2)。

57、众所周知，抗体特异性结合限定的靶分子或抗原，并且这意味着抗体优先且选择性地结合其靶标而不是非靶标的分子。

58、根据本发明的第一抗体和第二抗体(ctla-4、pd1、pd-l1)的靶标或根据本发明使用的第一抗体和第二抗体的靶标在细胞表面上表达，即，这些靶标是细胞表面抗原，其将包括抗体的表位(在该语境中又称为细胞表面表位)。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学领域技术人员容易理解的术语。

59、所谓“细胞表面抗原”，包括：本文所述抗体分子在细胞膜的细胞外侧上向其暴露的细胞表面抗原或至少其表位。

60、评估蛋白质结合的方法是生物化学和免疫学领域技术人员已知的。技术人员将理解，这些方法可以用于评估抗体与靶标的结合和/或抗体的fc结构域与fc受体的结合；以及相对强度或特异性，或者这些相互作用的抑制、预防或减小。可以用于评估蛋白质结合的方法的实例为，例如，免疫测定、biacore、蛋白质印迹、放射性免疫测定(ria)和酶联免疫吸附测定(elisa)(关于抗体特异性的讨论，参见fundamental immunology第二版，ravenpress,new york，第332至332页(1989))。

61、因此，本文中的“与ctla-4特异性结合的抗体分子”和“抗ctla-4抗体分子”均指与靶标ctla-4特异性结合但不与非靶标结合，或者相比靶标以弱得多的强度(诸如以较低的亲和力)与非靶标结合的抗体分子。

62、类似地，本文中的“与pd-1特异性结合的抗体分子”和“抗pd-1抗体分子”均指与靶标pd-1特异性结合但不与非靶标结合，或者相比靶标以弱得多的强度(诸如以较低的亲和力)与非靶标结合的抗体分子。

63、本文中的“与pd-l1特异性结合的抗体分子”和“抗pd-l1抗体分子”均指与靶标pd-l1特异性结合但不与非靶标结合，或者相比靶标以弱得多的强度(诸如以较低的亲和力)与非靶标结合的抗体分子。

64、在一些实施方案中，特异性结合ctla-4的抗体分子(或抗ctla-4抗体分子)是指与ctla-4的细胞外结构域特异性结合的抗体分子。在一些实施方案中，特异性结合pd-1的抗体分子(或抗pd-1抗体分子)是指与pd-1的细胞外结构域特异性结合的抗体分子。在一些实施方案中，特异性结合pd-l1的抗体分子(或抗pd-l1抗体分子)是指与pd-l1的细胞外结构域特异性结合的抗体分子。

65、我们还提出以下含义：抗体与靶标ctla-4或pd-1或pd-l1特异性结合的强度是抗体与非靶标特异性结合的强度的至少两倍、或至少五倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少500倍、或至少约1000倍。

66、此外，我们提出以下含义：如果抗体以至少约10-1m、或至少约10-2m、或至少约10-3m、或至少约10-4m、或至少约10-5m、或至少约10-6m、或至少约10-7m、或至少约10-8m、或至少约10-9m、或至少约10-10m、或至少约10-11m、或至少约10-12m、或至少约10-13m、或至少约10-14m、或至少约10-15m的解离常数(kd)与靶标ctla-4或pd-1或pd-l1结合，则抗体与该靶标特异性结合。

67、如上文所讨论的，本发明的溶瘤病毒表达特异性结合ctla-4的抗体。

68、在一些实施方案中，与ctla-4特异性结合的抗体分子是fcγ受体接合抗体。

69、在一些实施方案中，第一抗体分子选自由伊匹木单抗和曲美木单抗组成的组。

70、在一些实施方案中，特异性结合ctla-4的抗体分子(或抗ctla-4抗体分子)不与cd28交叉反应。在一些实施方案中，特异性结合ctla-4的抗体分子(或抗ctla-4抗体分子)阻断ctla-4与cd80和/或cd86的结合，从而抑制ctla-4信号传导。

71、在一些实施方案中，与伊匹木单抗相比，本文所述与ctla-4特异性结合的抗体分子(或抗ctla-4抗体分子)对ctla-4阳性细胞具有改善的耗竭作用。

72、抗体分子对ctla-4阳性细胞具有消耗作用意指在施用于受试者如人后，这样的抗体与在ctla-4阳性细胞表面上表达的ctla-4特异性结合，并且这种结合导致这类细胞的消耗。

73、在一些实施方案中，ctla-4阳性细胞是cd4阳性(cd4+)细胞，即表达cd4的细胞。

74、在一些实施方案中，ctla-4阳性细胞为cd4阳性和foxp3阳性两者，即表达cd4和foxp3。这些细胞是treg。cd8阳性t细胞也表达ctla-4，但tregs表达的cdla-4水平明显高于cd8阳性t细胞。与较低表达cd8+细胞相比，这使treg更易于耗竭。

75、在一些情况下，ctla-4优先在肿瘤微环境中的免疫细胞(肿瘤浸润细胞，til)上表达。

76、因此，在肿瘤微环境中，treg将是具有最高ctla-4表达的细胞，从而使得与ctla-4特异性结合的抗体分子(或抗ctla-4抗体分子)具有treg耗竭作用。

77、因此，在一些实施方案中，与ctla-4特异性结合的抗体分子是treg耗竭抗体。

78、如上文所提及，本文所述的抗ctla-4抗体分子可以是treg耗竭抗体分子，这意味着在施用于受试者(诸如人类)后，这样的抗体分子与在treg表面上表达的ctla-4特异性结合，并且这种结合引起treg耗竭。

79、为了确定抗体分子是否为具有本文所提及的treg耗竭作用的抗体分子(例如，与伊匹木单抗相比，这可能是改善的耗竭作用)，可以使用体外抗体依赖性细胞毒性(adcc)测定或pbmc-nog/scid模型中的体内测试。

80、体外adcc测试，其使用经稳定转染以表达cd16-158v等位基因与gfp的nk-92细胞系执行，其中adcc测试包括以下连续的七个步骤：

81、1)从健康供体的外周血中分离出ctla-4阳性细胞、cd4阳性细胞或treg作为靶细胞。该分离可以使用cd4+ t细胞分离试剂盒(诸如来自miltenyi biotec的商业试剂盒)来进行。

82、2)然后用cd3/cd28，例如使用cd3/cd28和rhil-2，如50ng/ml rhil-2，刺激靶细胞例如持续48小时。刺激可以在37℃下进行。

83、3)然后将靶细胞与待测试的抗体分子例如以10μg/ml在4℃下预温育30分钟，并且然后与nk细胞混合。

84、4)然后将靶细胞在含有hepes缓冲液、丙酮酸钠和fbs低igg的rpmi 1640+glutamax培养基中温育持续适当的时间，如4小时。rpmi 1640+glutamax培养基可以含有10mm hepes缓冲液、1mm丙酮酸钠和10％ fbs低igg，并且效应子与靶细胞的比率可以为2:1。

85、5)通过流式细胞术测定裂解。

86、6)重复或并行执行步骤1至5，其中使用伊匹木单抗(作为对照)代替步骤3中的测试抗体分子。

87、7)将测试的抗体分子的裂解结果与伊匹木单抗的裂解结果进行比较。测试的抗体分子与伊匹木单抗相比改善的裂解表明测试的抗体分子对ctla-4阳性细胞、cd4阳性细胞或treg具有改善的消耗作用，这分别取决于使用哪种靶细胞。

88、在一些实施方案中，以上步骤7)中的改善的消耗作用是显著改善的消耗作用。

89、体内测试是基于pbmc小鼠和nog/scid小鼠的组合使用，这在本文中称为pbmc-nog/scid模型。pbmc小鼠和nog/scid小鼠都是众所周知的模型。pbmc-nog/scid模型中的体内测试包括以下连续的九个步骤：

90、1)将人pbmc(外周血单核细胞)分离、洗涤并重悬于无菌pbs中。在一些实施方案中，以75×106个细胞/ml将pbmc重悬于pbs中。

91、2)向nog小鼠i.v.(静脉内)注射适当量(如200μl)的来自步骤1)的细胞悬浮液。如果注射200μl，则这对应于15×106个细胞/小鼠。

92、3)在注射之后的合适时间，诸如2周，从nog小鼠分离脾脏，使其成为单细胞悬浮液。任选地，从单细胞悬浮液中取出少量样品，以通过facs确定ctla-4在人t细胞上的表达，以便确认ctla-4表达。

93、4)将来自步骤3)的细胞悬浮液重悬于无菌pbs中。在一些实施方案中，以50×106个细胞/ml将细胞悬浮液重悬于无菌pbs中。如果步骤3中包含了任选的ctla-4表达确定，则其余的细胞悬浮液将在步骤4中重新悬浮。

94、5)向scid小鼠i.p.(腹膜内)注射适量(诸如200μl)来自步骤4的悬浮液。如果注射200μl，则这对应于10×106个细胞/小鼠。

95、6)在步骤5)中的注射之后合适的时间，如1小时，用适当量(如10mg/kg)的待测抗体分子、伊匹木单抗或同种型对照单克隆抗体处理scid小鼠。

96、7)在步骤6)中的处理之后的合适时间，诸如24小时，收集经处理的scid小鼠的腹膜内液。

97、8)使用以下标志物由facs鉴定人t细胞亚群并对其进行定量：cd45、cd4、cd8、cd25和/或cd127。

98、9)将来自用测试的抗体分子处理的小鼠的t细胞亚群的鉴定和定量结果与来自用伊匹木单抗处理的小鼠的t细胞亚群的鉴定和定量结果以及来自用同种型对照单克隆抗体处理的小鼠的t细胞亚群的鉴定和定量结果进行比较。与用伊匹木单抗处理的小鼠的腹膜液中的ctla-4阳性细胞的数量相比，用待测试的抗体分子处理的小鼠的腹膜液中的ctla-4阳性细胞数量较少，表明与伊匹木单抗相比，抗体分子对ctla-4阳性细胞具有改善的消耗作用。与用伊匹木单抗处理的小鼠的腹膜内液中的cd4阳性细胞数量相比，用待测试抗体分子处理的小鼠的腹膜内液中的cd4阳性细胞数量较少，表明与伊匹木单抗相比，该抗体分子对cd4阳性细胞具有改善的耗竭作用。与用伊匹木单抗处理的小鼠的腹膜液中的treg数量相比，用待测试的抗体分子处理的小鼠的腹膜液中的treg数量较少，表明与伊匹木单抗相比，抗体分子对treg具有改善的消耗作用。

99、在该体内测试中，在一些实施方案中，最感兴趣的是观察步骤7中的treg消耗。

100、如技术人员已知的，也可以在抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)测定中评估treg消耗。

101、在一些实施方案中，与yervoy(伊匹木单抗)相比，抗体分子对ctla-4与b7.1配体和b7.2配体的相互作用具有相似的阻断作用。这可以通过elisa或在更具功能性的测定中进行评估，在该更具功能性的测定中，抗ctla-4抗体响应于用葡萄球菌肠毒素b(seb)刺激pbmc，增强t细胞产生il-2。

102、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是人源化抗体分子。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是人源的抗体分子，这意味着它源自随后被修饰的人抗体分子。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是人igg1抗体。

103、在一些实施方案中，与ctla-4特异性结合的第一抗体分子选自由以下项组成的组：人igg抗体、人源化igg抗体和人源igg抗体。

104、在一些实施方案中，与ctla-4特异性结合的第一抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，fab、fv、scfv、fab'和(fab')2)组成的组。

105、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是以下人igg1抗体形式的抗体：其表现出与一个或几个活化性fc受体的结合改善并且/或者经工程改造以改善与一个或几个活化性fc受体的结合；因此，在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是经fc工程改造的人igg1抗体。

106、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是鼠或人源化鼠igg2a抗体。

107、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是与人ctla-4交叉反应的鼠抗体。

108、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是单克隆抗体或单克隆来源的抗体分子。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是多克隆抗体。

109、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是包括下表1中呈现的三个替代vh-cdr1序列之一、三个替代vh-cdr2序列之一、两个替代vh-cdr3序列之一、两个vl-cdr1序列之一、两个vl-cdr2序列之一和/或两个替代vl-cdr3序列之一的抗体分子。

110、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子选自由包括cdr中的1至6个的抗体分子组成的组，所述cdr选自由seq id.no:3、6、8、10、12和14组成的组。

111、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子选自由包含具有seq id.no:3、6、8、10、12和14的cdr的抗体分子组成的组。

112、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子选自由包括cdr vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1和vl-cdr3中的1至6个的抗体分子组成的组，

113、其中vh-cdr1，如果存在的话，选自由seq id.no:15、22、29和35组成的组；

114、其中vh-cdr2，如果存在的话，选自由seq id.no:16、23、30和36组成的组；

115、其中vh-cdr3，如果存在的话，选自由seq id.no:17、24、31和37组成的组；

116、其中vl-cdr1，如果存在的话，选自由seq id.no:10和38组成的组；

117、其中vl-cdr2，如果存在的话，选自由seq id.no:18、25、32和39组成的组；

118、其中vl-cdr3，如果存在的话，选自由seq id.no:19、26和40组成的组。

119、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是选自由包括6个cdr的抗体分子组成的组的抗体分子，所述6个cdr选自由以下组成的组：

120、seq id.no:15、16、17、10、18和19；

121、seq id.no:22、23、24、10、25和26；

122、seq id.no:29、30、31、10、32和26；以及

123、seq id.no:35、36、37、38、39和40。

124、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是包含具有seq id.no:15、16、17、10、18和19的6个cdr的抗体分子。

125、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是包含具有seq id.no:22、23、24、10、25和26的6个cdr的抗体分子。

126、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是选自由包括vh的抗体分子组成的组的抗体分子，所述vh选自由以下组成的组：seq id.no:20、27、33和41。

127、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是选自由包括vl的抗体分子组成的组的抗体分子，所述vl选自由以下组成的组：seq id.no:21、28、34和42。

128、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是选自由包括vh和vl的抗体分子组成的组的抗体分子，所述vh和vl选自由以下组成的组：seqid.no:20-21、27-28、33-34和41-42。

129、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子包括具有序列seq id.no:20的vh和具有序列seq id.no:21的vl。

130、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子包括具有序列seq id.no:27的vh和具有序列seq id.no:28的vl。

131、在一些实施方案中，第一抗体分子包含选自由seq.id.no:20和27组成的组的可变重链。在一些附加或替代性实施方案中，第一抗体分子包含选自由seq id no:21和28组成的组的可变轻链。

132、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子包含具有序列seq id no:43的重链恒定区(ch)。在一些附加或替代性实施方案中，抗ctla-4抗体分子包含具有序列seq id no:44的轻链恒定区(cl)。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子包含具有seq id no:43和44的恒定区。

133、表1：本文公开的抗体的一般cdr序列

134、

135、

136、表2：特异性抗ctla-4抗体分子；cdr序列在完整的vh序列和vl序列中以粗体标记。

137、

138、

139、

140、在一些实施方案中，本文所述的抗ctla-4抗体分子还可包括下表3中所呈现的恒定区中的一个或两个。

141、表3：本文公开的抗体的恒定区的序列

142、

143、在一些实施方案中，抗ctla-4抗体分子是由下表4中所呈现的核苷酸序列之一编码的分子。

144、表4：编码抗ctla-4抗体分子的特定核苷酸序列

145、

146、

147、

148、

149、

150、

151、在一些实施方案中，有利的是抗体分子既与人ctla-4(hctla-4)又与恒河猴ctla-4(cmctla-4或cyno ctla-4)结合。与恒河猴(也称为食蟹猕猴或短尾猕猴)中的细胞上表达的ctla-4的交叉反应可能是有利的，因为这使得能够在猴中测试抗体分子而不必使用替代抗体，这特别关注耐受性。

152、在一些实施方案中，抗体分子既与人ctla-4(hctla-4)又与鼠ctla-4(mctla-4)结合是有利的。这可能是有利的，因为这使得能够在小鼠中测试抗体分子，特别关注效果和药效学，而不必使用替代抗体。

153、在一些实施方案中，抗体分子与所有三个hctla-4、cmctla-4和mctla-4结合。

154、在一些实施方案中，有必要使用替代抗体在小鼠体内相关模型中测试抗体分子的功能活性。为了确保抗体分子在人体内的作用与替代抗体在小鼠体内的体内结果之间的可比性，有必要选择具有与人抗体分子相同的体外特性的功能等同替代抗体。

155、在一些实施方案中，与ctla-4特异性结合的第一抗体分子不结合人cd28。

156、如本文所讨论的，第二抗体可以与pd-1特异性结合。在一些实施方案中，与pd-1特异性结合的抗体分子选自抗pd-1抗体的以下非限制性实例中的一者或多者：

157、·派姆单抗(目前批准使用)；

158、·纳武单抗(目前批准使用)；

159、·西米普利单抗(目前批准使用)；

160、·卡瑞利珠单抗(目前批准使用)；

161、·斯巴达珠单抗(目前处于临床开发阶段)；

162、·多塔利单抗(目前处于临床开发阶段)；

163、·替雷利珠单抗(目前处于临床开发阶段)；

164、·jtx-4014(目前处于临床开发阶段)；

165、·信迪利单抗(ibi308)(目前处于临床开发阶段)；

166、·特瑞普利单抗(js 001)(目前处于临床开发阶段)；

167、·amp-224(目前处于临床开发阶段)；

168、·amp-514(medi0680)(目前处于临床开发阶段)。

169、在一个优选的实施方案中，与pd-1特异性结合的抗体是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或卡瑞利珠单抗。在一些实施方案中，与pd-1特异性结合的抗体是这些抗体中的两者或更多者的组合。在一个优选的实施方案中，与pd-1特异性结合的抗体是派姆单抗。

170、在一些实施方案中，抗pd-1抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗pd-1抗体分子是人源化抗体分子。

171、在一些实施方案中，抗pd-1抗体分子是人源抗体分子，这意味着它源自随后经过修饰的人抗体分子。

172、在一些实施方案中，抗pd-1抗体分子是人igg1抗体。

173、在一些实施方案中，抗pd-1抗体是以下人igg1抗体形式的抗体：其表现出与一个或几个活化性fc受体的结合改善并且/或者经工程改造以改善与一个或几个活化性fc受体的结合；因此，在一些实施方案中，抗pd-1抗体是经fc工程改造的人igg1抗体。

174、在一些实施方案中，抗pd-1抗体是鼠或人源化鼠igg2a抗体。

175、在一些实施方案中，与pd-1特异性结合的第二抗体分子选自由以下项组成的组：人抗体分子、人源化抗体分子和人源抗体分子。

176、在一些实施方案中，与pd-1特异性结合的第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，fab、fv、scfv、fab'和(fab')2)组成的组。

177、在一些实施方案中，与pd-1特异性结合的第二抗体分子选自由以下项组成的组：人igg抗体、人源化igg抗体和人源igg抗体。

178、在一些实施方案中，抗pd-1抗体是与人pd-1交叉反应的鼠抗体。

179、在一些实施方案中，抗pd-1抗体是单克隆抗体或单克隆来源的抗体分子。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是多克隆抗体。

180、在一些实施方案中，第二抗体分子可以与pd-l1特异性结合。在一些实施方案中，与pd-l1特异性结合的抗体分子选自抗pd-l1抗体的以下非限制性实例中的一者或多者：

181、·阿特珠单抗(目前批准使用)；

182、·德瓦鲁单抗(目前批准使用)；

183、·阿维鲁单抗(目前批准使用)；

184、·cs1001(目前处于临床开发阶段)；

185、·kn035(恩沃利单抗)-目前在美国、中国和日本进行临床评估的pd-l1抗体皮下制剂；

186、·ck-301(目前正由checkpoint therapeutics进行临床开发)

187、在一个优选的实施方案中，与pd-l1特异性结合的抗体是阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。在一些实施方案中，与pd-l1特异性结合的抗体是这些抗体中的两者或更多者的组合。

188、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体分子是人抗体分子。

189、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体分子是人源化抗体分子。

190、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体分子是人源抗体分子，这意味着它源自随后经过修饰的人抗体分子。

191、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体分子是人igg1抗体。

192、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是以下人igg1抗体形式的抗体：其表现出与一个或几个活化性fc受体的结合改善并且/或者经工程改造以改善与一个或几个活化性fc受体的结合；因此，在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是经fc工程改造的人igg1抗体。

193、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是鼠或人源化鼠igg2a抗体。

194、在一些实施方案中，与pd-l1特异性结合的第二抗体分子选自由以下项组成的组：人抗体分子、人源化抗体分子和人源抗体分子。

195、在一些实施方案中，与pd-l1特异性结合的第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，fab、fv、scfv、fab'和(fab')2)组成的组。

196、在一些实施方案中，与pd-l1特异性结合的第二抗体分子选自由人igg抗体、人源化igg抗体和人源igg抗体组成的组。

197、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是与人pd-l1交叉反应的鼠抗体。

198、在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是单克隆抗体或单克隆来源的抗体分子。在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是多克隆抗体。

199、如本文所述，本发明涉及能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒。

200、如本文所用，术语“溶瘤”是指病毒在分裂细胞(例如增殖性细胞，诸如癌细胞)中选择性复制的能力，其目的是在体外或在体内减慢所述分裂细胞的生长和/或裂解，而在非分裂(例如正常或健康)细胞中不表现出或只表现出极少的复制。

201、“复制(replication)”(或任何形式的复制，如“复制(replicate)”和“复制(replicating)”等)意指病毒的复制，这可以在核酸水平或优选在传染性病毒颗粒水平发生。可以从目前鉴定的病毒的任何成员获得这样的溶瘤病毒。它可以是天然溶瘤的天然病毒，也可以通过修饰一个或多个病毒基因进行工程改造，从而提高肿瘤选择性并且/或者在分裂细胞中优先复制，诸如参与dna复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散的那些(参见例如，wong等人，2010,viruses 2:78-106)。还可以设想将一种或多种病毒基因置于事件或组织特异性调控元件(例如启动子)的控制之下。

202、示例性溶瘤病毒无限制地包括：呼肠孤病毒、塞内卡山谷病毒(svv)、水疱性口炎病毒(vsv)、新城鸡瘟病毒(ndv)、单纯疱疹病毒(hsv)、麻疹病毒、腺病毒、痘病毒、逆转录病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、α病毒、慢病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒、棒状病毒、小核糖核酸病毒、柯萨基病毒、细小病毒，诸如此类。此类病毒是医学领域和病毒学领域的技术人员已知的。

203、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒获自疱疹病毒。疱疹病毒科是一个大家族的dna病毒，它们都具有相同的结构，并且由相对大的双链线性dna基因组构成，所述基因组编码被包裹二十面体衣壳内的100-200个基因，所述二十面体衣壳被包膜在脂质双层膜中。尽管溶瘤疱疹病毒可以衍生自不同类型的hsv，但是特别优选的是hsv1和hsv2。可以对疱疹病毒进行基因修饰，以便限制在肿瘤中的病毒复制或降低其在非分裂细胞中的细胞毒性。例如，可以使参与核酸代谢的任何病毒基因失活，诸如胸苷激酶(martuza等人，1991,science252:854-6)、核糖核苷酸还原酶(rr)(mineta等人，1994,cancer res.54:3363-66)，或尿嘧啶-n-糖基化酶(pyles等人，1994,j.virol.68:4963-72)。另一方面涉及病毒突变体，其在编码毒力因子的基因(诸如icp34.5基因)的功能上有缺陷(chambers等人，1995,proc.natl.acad.sci.usa 92:1411-5)。溶瘤疱疹病毒的代表性实例包括nv1020(例如，geevarghese等人，2010,hum.gene ther.21(9):1119-28)和t-vec(harrington等人，2015,expert rev.anticancer ther.15(12):1389-1403)。

204、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒获自腺病毒。方法是本领域可用于工程改造溶瘤腺病毒的。一种有利的策略包含用肿瘤选择性启动子替换病毒启动子或修饰e1腺病毒基因产物，以使其在肿瘤细胞中改变的与p53或视网膜母细胞瘤(rb)蛋白的结合功能失活。在自然环境中，腺病毒e1b55kda基因与另一种腺病毒产物协同作用使p53失活(p53在癌细胞中经常失调)，从而防止了细胞凋亡。溶瘤腺病毒的代表性实例包含onyx-015(例如，khuri等人,2000,《自然医学(nat.med)》6(8):879-85)和也称为oncorine的h101(xia等人,2004,《癌症(ai zheng)》23(12):1666-70)。

205、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒是溶瘤痘病毒。如本文所用，术语“痘病毒”是指属于痘病毒科的病毒，特别优选属于脊索痘病毒亚科(the chordopoxviridaesubfamily)的痘病毒，并且更优选属于正痘病毒属(the orthopoxvirus genus)的痘病毒。痘苗病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、鼠痘病毒和粘液瘤病毒特别适合于本发明的上下文中。这类痘病毒的基因组序列可在本领域和专门的数据库中获得(例如genbank，登录号分别为nc_006998、nc_003663或af482758.2、nc_005309、nc_004105、nc_001132)。

206、在具体和优选的实施方案中，这样的溶瘤痘病毒是溶瘤痘苗病毒。痘苗病毒是特征在于200kb双链dna基因组的痘病毒家族的成员，所述基因组编码多种病毒酶和使病毒能够独立于宿主细胞机制进行复制的因子。大部分痘苗病毒颗粒借助单个脂质包膜在细胞内(对于细胞内成熟病毒体，imv)，并保留在感染细胞的胞液质中直至裂解。另一种传染性形式是双被包膜的颗粒(对于细胞外被包膜的病毒体，eev)，它从被感染的细胞中发芽而不会使其裂解。尽管它可以来源于任何痘苗病毒株，但特别优选埃尔斯特里(elstree)、怀斯(wyeth)、哥本哈根(copenhagen)、利斯特(lister)和西储(western reserve)株。除非另有说明，否则本文所用的基因命名法是哥本哈根痘苗株的命名法。但是，哥本哈根和其他痘苗株之间的对应关系通常可在文献中获得。

207、优选地，通过改变一种或多种病毒基因来修饰这样的溶瘤痘苗病毒。所述(一种或多种)修饰优选导致缺乏合成或缺陷性病毒蛋白的合成，所述缺陷性病毒蛋白不能确保未修饰基因在正常条件下产生的蛋白的活性。在文献中公开了示例性修饰，其目的是改变参与dna代谢、宿主毒力、ifn通路的病毒基因(例如，guse等人，2011,expert opinionbiol.ther.11(5):595-608)等等。用于改变病毒基因座的修饰涵盖病毒基因或其调控元件内一个或多个核苷酸(连续或不连续)的缺失、突变和/或取代。可以通过本领域技术人员已知的多种方式使用常规重组技术进行(一种或多种)修饰。

208、更优选地，通过改变胸苷激酶编码基因(基因座j2r)来修饰这样的溶瘤痘苗病毒。胸苷激酶(tk)酶参与脱氧核糖核苷酸的合成。正常细胞中的病毒复制需要tk，因为这些细胞通常具有低浓度的核苷酸，而在含有高核苷酸浓度的分裂细胞中它是可有可无的。

209、替代性地，或与之结合，通过改变编码核糖核苷酸还原酶(rr)的至少一个或两个基因来修饰这样的溶瘤痘苗病毒。在自然环境中，该酶催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，这是dna生物合成中的关键步骤。病毒酶的亚基结构与哺乳动物酶相似，由两个异源亚基构成，设计分别由i4l和f4l基因座编码的r1和r2。在本发明的上下文中，可以使i4l基因(编码r1大亚基)或f4l基因(编码r2小亚基)或两者失活(例如，如wo2009/065546和foloppe等人,2008,《基因疗法gene ther.)》,15:1361-71中所述)。j2r、i4l和f4l基因的序列及其在各种痘病毒基因组中的位置可在公共数据库中获得。

210、因此，在一些实施方案中，溶瘤病毒的胸苷激酶(tk)和/或核糖核苷酸还原酶(rr)活性有缺陷。在一些实施方案中，溶瘤病毒是胸苷激酶(tk)和/或核糖核苷酸还原酶(rr)活性有缺陷的痘苗病毒。

211、在一些实施方案中，溶瘤病毒包含编码如本文所定义的第一抗体分子的核苷酸序列。

212、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码与上表2中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表2中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表2中列出的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表2中列出的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

213、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码seq.id.no:20和id.no:21的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码seq.id.no:27和id.no:28的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码seq.id.no:33和id.no:34的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码seq.id.no:41和id.no:42的核苷酸序列。

214、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。

215、在一些实施方案中，该核苷酸序列包括选自由seq id no:45-52组成的组的序列，或者由选自由seq id no:45-52组成的组的序列组成。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含seq.id.no:45和46。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含seq.id.no:47和48。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含seq.id.no:49和50。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含seq.id.no:51和52。

216、一些溶瘤病毒具有容纳足够大的dna插入以适应全长人抗体序列整合的能力。减弱型痘苗病毒和单纯疱疹病毒是其基因组大到足以允许整合全长igg抗体序列的治疗性溶瘤病毒的实例(chan和mcfadden，2014；bommareddy、shettigar等人，2018)。全长igg抗体已成功整合到溶瘤痘苗病毒中，其结果是，在感染病毒易感宿主细胞(例如癌细胞)后，全长igg抗体表达并向细胞外释放(产生)(kleinpeter等人，2016)。腺病毒也可以经工程改造以编码在细胞感染时功能性地产生并分泌的全长igg抗体(marino等人，2017)。

217、在一个优选的实施方案中，这样的溶瘤病毒是痘病毒(例如，痘苗病毒)，该痘病毒的tk活性有缺陷(由于j2r基因座改变而引起)或者tk和rr这两种活性有缺陷(由于j2r基因座以及编码rr的i4l和/或f4l基因座中的至少一个基因座这两者改变而引起)并且包含(a)编码seq.id.no:20和id.no:21的核苷酸序列或(b)编码seq.id.no:27和id.no:28的核苷酸序列或(c)编码seq.id.no:33和id.no:34的核苷酸序列或(d)编码seq.id.no:41和id.no:42的核苷酸序列。

218、在一些实施方案中，可以通过在相关基因座(即，j2r、i4l和/或f4l基因座)内引入编码第一抗体分子的核苷酸序列来破坏tk活性和rr活性。在一些优选的实施方案中，病毒包含插入病毒j2r基因座处的编码第一抗体分子的重链的核苷酸序列并且/或者包含插入病毒i4l基因座处的编码第一抗体分子的轻链的核苷酸序列。

219、在适当的时候，可能有利的是插入本文所述的溶瘤病毒中的(一个或多个)核苷酸序列包含促进表达、运输和生物学活性的附加调控元件。例如，可以包含信号肽，以促进在生产者细胞(例如，受感染细胞)外的分泌。通常将信号肽紧接在met引发剂之后插入编码的多肽的n端。信号肽的选择是广泛的，并且是本领域技术人员可及的。例如，源自另一种免疫球蛋白的信号肽(例如重链igg)可用于本发明的上下文中，以允许本文所述的抗ctla4抗体在生产者细胞外分泌。出于说明的目的，可以参考seq id no:53和seq id no:54，其包含本文所述4-e03抗体的轻链和重链，其中轻链和重链均配备有源自igg的肽信号。

220、特别优选的溶瘤病毒是痘苗病毒(例如，哥本哈根株)，该痘苗病毒的tk和rr这两种活性有缺陷(例如，由于j2r基因座和i4l基因座这两者改变而引起)并且包含编码seq.id.no:20和seq id.no:21或seq.id.no:53和seq id.no:54的核苷酸序列。

221、在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒可以还包含具有治疗意义的附加核苷酸序列，诸如编码免疫调节多肽(即，直接或间接参与刺激免疫应答的多肽)的核苷酸序列。合适的免疫调节多肽的代表性实例包括但不限于细胞因子和趋化因子，且特别优选的是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，特别是人、非人灵长类或鼠gm-csf。

222、因此，在一些实施方案中，能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒(例如，痘苗病毒)还包含编码gm-csf，优选人gm-csf(例如具有seq id no:55或seq idno:56)或鼠gm-csf(例如具有seq id no:57或seq id no:58)的核苷酸序列。

223、可以通过标准分子生物学技术(例如pcr扩增、cdna克隆、化学合成)使用本领域可获得的序列数据和本文提供的信息来容易地获得附加核苷酸序列。特别优选的溶瘤病毒是痘苗病毒(例如，哥本哈根株)，该痘苗病毒的tk和rr这两种活性有缺陷(由于j2r基因座和i4l基因座这两者改变而引起)并且包含编码seq.id.no:20和id.no:21或seq.id.no:53和seq id.no:54的核苷酸序列和编码gm-csf的核苷酸序列，其中特别优选的是人gm-csf(例如，具有seq id no:55或seq id no:56)或鼠gm-csf(例如，具有seq id no:57或seq idno:58)。

224、下表提供了本文所提及的gm-csf的序列：

225、

226、另外，可以通过修饰一个或多个密码子来优化要插入这样的溶瘤病毒中的核苷酸序列，以在特定宿主细胞或受试者中提供高水平表达。此外，为了优化密码子使用，还可以设想各种修饰，以防止在集中区域中存在稀有、非最佳密码子的聚类和/或抑制或修饰预期对表达水平有负面影响的“负”序列元件。此类负序列元件无限制地包括具有非常高(>80％)或非常低(<30％)的gc含量的区域；富含at或富含gc的序列延伸；不稳定的正向或反向重复序列；r a二级结构；和/或内部隐性调控元件，诸如内部tata盒、chi位点、核糖体进入位点，和/或剪接供体/受体位点。

227、在一些实施方案中，将(一个或多个)核苷酸序列置于合适的调控元件的控制下，以使其在宿主细胞或受试者中正确表达。如本文所用，术语“调控元件”是指允许、贡献或调节编码(一个或多个)核苷酸序列在给定宿主细胞或受试者中的表达的任何元件，包含其复制、复制、转录、剪接、翻译、稳定性和/或在表达细胞内或外的运输。本领域技术人员将理解，调控元件的选择可以取决于如核苷酸序列本身、其被插入其中的病毒、宿主细胞或受试者、所需表达水平等因素。启动子特别重要。在本发明的上下文中，它可以是它在许多类型的宿主细胞中控制的或特定于某些宿主细胞或响应于特定事件或外源因素(例如，通过温度、营养添加剂、激素等)或根据病毒周期的阶段(例如晚期或早期)调节的核苷酸序列的组成型指导表达。适于病毒介导的表达的启动子是本领域已知的。

228、由溶瘤痘病毒表达的代表性实例无限制地包括痘苗p7.5k、ph5.r、p11k7.5、tk、p28、p11、pb2r、pa35r、k1l和pse/l启动子(erbs等人，2008,cancer gene ther.15(1):18-28；orubu等人，2012,plos one 7:e40167)，早期/晚期嵌合启动子与合成启动子(chakrabarti等人，1997,biotechniques 23:1094-7；hammond等人，1997,j.virolmethods 66:135-8；以及kumar和boyle，1990,virology 179:151-8)。在优选的实施方案中，将本文所述抗体的轻链和重链的核苷酸序列分别置于具有相同转录强度的启动子的控制下，并且优选地置于相同启动子(例如p7.5k，诸如以seq id no:59描述的启动子，或ph5.r，诸如以seq id no:60描述的启动子)的控制下，以对于两条链获得相似表达水平，因此抗体作为异四聚体蛋白进行最佳组装(即，避免过多的非缔合链)。可以将附加核苷酸序列(例如编码gm-csf)置于不同启动子(例如pse/l，诸如以seq id no:61描述的启动子)的控制下。

229、下表提供了上文所提及的启动子的序列：

230、

231、通过常规手段，使用适当的限制酶或优选地通过同源重组，在这样的溶瘤病毒的基因组中插入核苷酸序列(可能装备有适当的调控元件)。(一个或多个)核苷酸序列可以独立地插入病毒基因组的任何位置。可以考虑各种插入位点，例如在这样的溶瘤病毒的基因组的非必需病毒基因、基因间区域或非编码部分中。j2r基因座和/或i4l基因座特别适合于作为痘病毒的溶瘤病毒(例如溶瘤痘苗病毒)。在将核苷酸序列插入病毒基因组中后，插入位点处的病毒基因座可能至少部分缺失。在一个实施方案中，这种缺失或部分缺失可导致由全部或部分缺失的基因座编码的病毒基因产物的表达受到抑制，从而导致对于所述病毒功能的有缺陷病毒。特别优选的溶瘤病毒是包括编码插入j2r基因座处的重链的盒与编码插入i4l基因座处的轻链的盒的tk和/或rr缺陷性痘苗病毒。可以将编码附加gm-csf编码的核苷酸序列的盒插入病毒基因组的另一个位置或者j2r或i4l基因座中，且优选插入i4l基因座处。

232、本发明还提供了一种在合适的宿主细胞(生产者细胞)中生成本文所述的这种溶瘤病毒，特别是溶瘤痘病毒的方法。在一些实施方案中，这样的方法包括病毒基因组和转移质粒之间同源重组的一个或多个步骤，所述转移质粒包括要插入的(一个或多个)核苷酸序列(可能带有调控元件)，所述核苷酸序列侧接5'和3'，且病毒序列分别存在于插入位点的上游和下游。所述转移质粒可以通过常规技术(例如，通过转染)生成并引入宿主细胞中。可以通过感染将病毒基因组引入宿主细胞中。每个侧翼病毒序列的大小可以在核苷酸序列的每一侧上至少100bp到至多1500bp之间变化(优选200至550bp并且更优选250至500bp)。允许产生这样的溶瘤病毒的同源重组优选在培养的细胞系(例如赫拉(hela)、韦罗(vero))或从胚卵获得的鸡胚成纤维细胞(cef)细胞中进行。

233、在一些实施方案中，可以通过使用选择和/或可检测基因来促进对掺入了抗ctla4编码核苷酸序列以及可能的附加核苷酸序列(例如gm-csf)的溶瘤病毒的鉴定。

234、在优选的实施方案中，转移质粒进一步包括对gpt基因(编码鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)具有特定偏好的选择标志物，其允许在选择性培养基(例如在麦考酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的存在下)或编码可检测的基因产物如gfp、e-gfp或mcherry的可检测基因中生长。另外，还可以考虑使用能够在所述选择或可检测基因中能够提供双链断裂的核酸内切酶。所述核酸内切酶可以是蛋白质形式或由表达载体表达。

235、一旦生成，可以使用常规技术将这样的溶瘤病毒扩增到合适的宿主细胞中，所述常规技术包含在合适的条件下培养转染或感染的宿主细胞，以允许产生和回收感染性颗粒。

236、本发明还涉及用于产生本文所述的溶瘤病毒的方法。优选地，所述方法包括以下步骤：a)制备生产者细胞系，b)用溶瘤病毒转染或感染制备的生产者细胞系，c)在合适的条件下培养转染或感染的生产者细胞系，以便产生病毒，d)从所述生产者细胞系的培养物中回收产生的病毒，以及任选地e)纯化所述回收的病毒。

237、在一些实施方案中，生产者细胞选自由以下项组成的组：哺乳动物(例如人或非人)细胞，诸如hela细胞(例如atcc-crm-ccl-2tm或atcc-ccl-2.2tm)、her96、per-c6(fallaux等人，1998,human gene ther.9:1909-17)、仓鼠细胞系诸如bhk-21(atcc ccl-10)等，以及禽细胞诸如在wo2005/042728、wo2006/108846、wo2008/129058、wo2010/130756、wo2012/001075中描述的那些，以及由获自受精卵的鸡胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(cef)。生产者细胞优选在适当的培养基中培养，如果需要，所述培养基可以补充血清和/或(一种或多种)合适的生长因子或不补充(例如化学成分确定的培养基，优选不含动物或人类来源的产物)。取决于生产者细胞，本领域技术人员可以容易地选择适当的培养基。这类培养基是可商购的。在感染前，优选在包括在+30℃和+38℃之间的温度下(更优选在约+37℃下)培养生产者细胞持续1和8天之间。如果需要，可以进行1至8天的几次传代，以增加细胞总数。

238、在步骤b)中，在适当的条件下，使用适当的感染复数(moi)，通过溶瘤病毒感染生产者细胞，以允许生产者细胞的生产性感染。为了说明的目的，适当的moi范围为10-3至20，且特别优选moi包括0.01至5，并且更优选0.03至1。感染步骤在可以与用于生产者细胞培养的培养基相同或不同的培养基中进行。

239、在步骤c)中，然后在本领域技术人员熟知的适当条件下培养感染的生产者细胞，直到产生子代病毒颗粒。感染的生产者细胞的培养还优选在+32℃和+37℃之间的温度下在可以与用于生产者细胞的培养和/或感染步骤的培养基/培养基相同或不同的培养基中执行，持续1至5天。

240、在步骤d)中，从培养上清液和/或生产者细胞中收集在步骤c)中产生的病毒颗粒。从生产者细胞中回收可能需要允许破坏生产者细胞膜以允许释放病毒的步骤。可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来诱导生产者细胞膜的破坏，包含但不限于冷冻/融化、低渗裂解、超声处理、微流化、高剪切(也称为高速)均质化或高压均质化。

241、回收的溶瘤病毒可以在按剂量分布并如本文所述使用前至少部分地纯化。本领域可获得大量的纯化步骤和方法，包含例如澄清、酶处理(例如核酸内切酶、蛋白酶等)、色谱和过滤步骤。适当的方法描述于本领域中(参见例如wo2007/147528、wo2008/138533、wo2009/100521、wo2010/130753、wo2013/022764)。

242、在一个实施方案中，本发明还提供了一种被能够表达本文所述第一抗体分子的溶瘤病毒感染的细胞。

243、能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒和与pd-1和/或pd-1特异性结合的第二抗体分子的组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

244、我们指出，受试者可以是哺乳动物或非哺乳动物。优选地，哺乳动物受试者是人类，或是非哺乳动物，诸如马、牛、羊、猪、骆驼、狗或猫。最优选地，哺乳动物受试者是人类。

245、患者可能表现出表明他们患有癌症的体征或症状。所谓“表现出”，包括：受试者显现癌症症状和/或癌症诊断标志物，并且/或者该癌症症状和/或癌症诊断标志物可以被测量和/或评估和/或量化。

246、医学领域技术人员很容易理解，癌症症状和癌症诊断标志物将是什么，以及如何测量和/或评估和/或量化癌症症状的严重性是降低还是增加，或者癌症诊断标志物是减少还是增加；以及能够如何使用这些癌症症状和/或癌症诊断标志物来形成癌症的预后。

247、癌症治疗通常作为疗程来施用，也就是说，在一段时间内施用治疗剂。疗程的时间长短取决于许多因素，这些因素可以包含所施用的治疗剂的类型、所治疗的癌症的类型、所治疗的癌症的严重程度以及受试者的年龄和健康状况，以及其它原因。

248、“在治疗期间”包含：受试者当前正在接受疗程、和/或正在接受治疗剂、和/或正在接受治疗剂疗程。

249、如上文所讨论的，能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒和与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子的组合特别可用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

250、因此，在一些实施方案中，通过第一抗体分子和第二抗体分子来治疗冷肿瘤。

251、技术人员应当理解，确定冷肿瘤是否已被“治疗”涉及用于任何其他类型肿瘤的相同类型的确定法。例如，技术人员将寻找多种体征，诸如可以使用ct扫描测量的肿瘤缩小(在经注射和未经注射这两类肿瘤中)，和/或无进展生存期，和/或总生存期。在其他情况下，这可能是更主观的效果，诸如由受试者报告的症状严重性降低。测量受试者对施用治疗性抗体的应答的治疗效果是本领域众所周知的。

252、“冷肿瘤”是指被炎性免疫细胞(最突出的是t细胞，特别是cd8+ t细胞)浸润不良的肿瘤。冷肿瘤具有高度临床相关性，因为肿瘤免疫浸润，尤其是cd8+ t细胞浸润已被广泛证明与具有不同组织学特征和解剖学定位的癌症的较长无病生存期(dfs)和/或总生存期(os)相关联。这已经在原发和转移这两种背景中得到证实(bruni等人，2020)，其中这些背景包括黑素瘤、大多数鳞状细胞癌(scc)、大细胞肺癌和几种类型的腺癌(galon等人，2006；fridman等人，2012；fridman等人，2017；hu等人，2018)，与对icb的应答相关联并且用于预测对icb的应答(galon和bruni，2019)。

253、例如，最近证实，cd8+ t细胞密度与在人类实体癌患者的以下疾病中使用抗ctla-4和pd-1/pd-l1抗体时对icb的应答/进展相关：黑素瘤(tumeh等人，2014)、肾细胞癌(mcdermott、huseni等人，2018)和nsclc(thommen、koelzer等人，2018)。类似地，很好理解的是，临床前小鼠肿瘤模型在免疫浸润方面存在定量和定性差异，b16/c57bl6模型在免疫细胞浸润(包括cd8+ t细胞)方面尤其不足(mosely等人，2017)。另外，与人“冷肿瘤”类似，b16/c57bl6模型在使用抗ctla-4和/或抗pd-1/l1时对全身性icb特别有耐药性，使得其可用于帮助鉴定有助于克服“冷肿瘤”对全身性icb的耐药性的疗法。

254、已经设计了量化肿瘤细胞、免疫细胞或复合细胞的pd-l1水平的临床相关测定，并且在临床上用于帮助鉴定使用抗pd-1/l1 icb试剂(例如派姆单抗)来治疗的患者(参见章节2.1的处方信息，其描述如何选择患者进行治疗-可在https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2021/125514s096lbl.pdf处获得)。

255、最近的数据，基于多色免疫荧光，鉴定了侵袭边缘cd8+ t细胞密度作为最佳全预测参数，并且鉴定了肿瘤cd8+ t细胞密度作为黑素瘤中对pd-1阻断疗法的应答/进展的第二最佳预测因子(tumeh等人，2014)。另外，主成分分析证明，cd8浸润、pd-1和pd-l1与治疗结果显著相关。这些数据支持cd8+ t细胞密度可能是用于鉴定冷肿瘤患者的有用方法。最近，开发了一种基于免疫的测定法，称为“免疫评分”，用于原位量化癌症患者肿瘤中的cd3+cd8+ t细胞浸润(bruni等人，2020；galon等人，2006；lanzi等人，2020)。

256、免疫评分是一种基于免疫组织化学和数字病理学的评分系统，用于评估肿瘤及其侵袭边缘中cd3+和cd8+ t细胞的密度。简言之，将承载福尔马林固定石蜡包埋肿瘤块的两个相邻载玻片置于自动染色仪中用抗cd3抗体和抗cd8抗体染色。然后扫描载玻片，使用数字病理学软件，将数字图像用于量化感兴趣细胞的密度。这些密度最终转化为免疫评分，范围从低免疫评分(i0)到高免疫评分(i4)。

257、galon和bruni已经提出了将免疫评分与“热肿瘤和冷肿瘤”的概念进行比对的方法(galon等人，2019；angell等人，2020)。使用这种方法，基于t细胞浸润将肿瘤分为四类：热免疫肿瘤；变异型免疫抑制性免疫肿瘤；变异型排斥免疫肿瘤；和冷肿瘤。

258、这四种肿瘤类型的特征详细描述于galon等人，2019的方框1中，其根据以下特征来描述肿瘤类型：

259、1.热免疫肿瘤(在本文中也称为热肿瘤)

260、-高度的t细胞和细胞毒性t细胞浸润(高免疫评分)

261、-检查点活化(程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)、t细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3(tim-3)和淋巴细胞活化基因3(lag-3))或以其他方式受损的t细胞功能(例如，细胞外钾驱动的t细胞抑制)

262、2.变异型免疫抑制性免疫肿瘤

263、-t细胞和细胞毒性t细胞浸润不良，但不是没有(中等免疫评分)

264、-存在可溶性抑制介质(转化生长因子-β(tgfβ)、白介素10(il-10)和血管内皮生长因子(vegf))

265、-存在免疫抑制细胞(骨髓源性抑制细胞和调节性t细胞)

266、-存在t细胞检查点(pd-1、ctla-4、tim-3和lag-3)

267、3.变异型排斥免疫肿瘤

268、-肿瘤床内无t细胞浸润；t细胞在肿瘤边界(侵袭边缘)处聚积(中等免疫评分)

269、-致癌通路活化

270、-肿瘤微环境的表观遗传调控和重编程

271、-肿瘤脉管系统和/或基质异常

272、-缺氧

273、4.冷免疫肿瘤(在本文中也称为冷肿瘤)

274、-肿瘤内和肿瘤边缘处不存在t细胞(低免疫评分)

275、-t细胞启动失败(肿瘤突变负荷低、抗原呈递不良，以及对t细胞杀伤固有的不敏感性)。

276、因此，在一些实施方案中，如果患者具有符合如上文所定义的变异型免疫抑制性免疫肿瘤、变异型排斥免疫肿瘤或冷免疫肿瘤的定义的肿瘤，则认为该患者具有冷肿瘤。

277、应当理解，上述类型肿瘤中的每一种将对t细胞检查点抑制具有不同水平的应答，其中冷免疫肿瘤具有最低水平的应答(无应答)，随后分别是变异型排斥免疫肿瘤和变异型免疫抑制性免疫肿瘤(具有次优的应答水平)。

278、本文所用的“冷肿瘤”定义，即免疫细胞(例如，cd3+和cd8+ t细胞)浸润不良的肿瘤，既涵盖经典的冷免疫肿瘤、变异型排斥肿瘤，也涵盖变异型免疫抑制性肿瘤，因为所有这些类别都是通过t细胞浸润不良(免疫变异型)或不存在(免疫排斥型和冷肿瘤)来定义的。这相当于癌症患者的免疫评分为i、ii或iii，而不是iv(后者是t细胞发炎肿瘤)。因此，本发明适用于具有免疫评分i、ii和iii而不是iv的患者。

279、因此，在一些实施方案中，如果肿瘤具有免疫评分i、ii或iii，则认为患者具有冷肿瘤。

280、本领域技术人员应当理解，除免疫评分或t细胞密度之外的其他测定法和技术也可以帮助鉴定特别具有耐药性的“冷型”癌症。

281、在一些实施方案中，冷肿瘤具有无反应性(或无能性)淋巴细胞。这意味着淋巴细胞对抗原没有应答。确定无能性淋巴细胞的方法是本领域熟知的。

282、在另一些实施方案中，冷肿瘤具有低水平的cd3阳性细胞。例如，冷肿瘤可以具有少于10％的cd3阳性细胞(占肿瘤中总细胞的百分比)，即，少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％的cd3阳性细胞，或不具有cd3阳性细胞。测量cd3阳性细胞的百分比的方法在本领域中是已知的。

283、如上文所讨论的，如本文所述的冷肿瘤是通常不被免疫系统良好靶向的肿瘤。在一些替代性或附加实施方案中，此类冷肿瘤还可以被分类为以下类型：

284、-免疫遗弃肿瘤，即，由于缺乏肿瘤浸润t细胞而在肿瘤中完全缺乏免疫应答。

285、-免疫排斥肿瘤，即，生成应答性t细胞，但不能渗入肿瘤以发动针对肿瘤的应答，t细胞可能存在于肿瘤周边。

286、-免疫浸润不良肿瘤，即，免疫细胞(t细胞)渗入肿瘤微环境的水平降低。

287、如本文中所用的所谓“冷肿瘤”，还包括所有免疫遗弃肿瘤、免疫排斥肿瘤，以及免疫浸润不良肿瘤。这些定义可以替代性地或附加地用于上文所讨论的冷肿瘤定义(变异型免疫抑制性免疫肿瘤、变异型排斥免疫肿瘤或冷免疫肿瘤)。在一些实施方案中，变异型免疫抑制性免疫肿瘤对应于免疫浸润不良的肿瘤。在一些实施方案中，变异型排斥免疫肿瘤对应于免疫排斥肿瘤。在一些实施方案中，冷免疫肿瘤对应于免疫遗弃肿瘤。

288、所谓“包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成”，是指可以由冷肿瘤和非冷肿瘤构成的癌症。例如，如果原发癌症(可能是冷肿瘤)已经转移并且形成非冷肿瘤的继发性肿瘤，则可能出现这种情况。本文的患者可能患有多种肿瘤，其中只有一种肿瘤需要满足冷肿瘤的要求，本发明就会有益处。在其他实施方案中，患者可以具有被认为是冷肿瘤的单个肿瘤。

289、可能属于这些“冷肿瘤”亚型的癌症包括但不限于以下癌症：黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、宫颈癌、梅克尔细胞癌、卵巢癌、头颈癌、间皮瘤或乳腺癌。

290、上述癌症中的每一种都是众所周知的，并且如用于治疗那些癌症的治疗剂一样对症状和癌症诊断标志物进行了很好的描述。因此，症状、癌症诊断标志物和用于治疗上文提及的癌症类型的治疗剂将为医学技术人员所知。

291、对大量癌症的诊断、预后和进展的临床定义依赖于被称为分期的某些分类。那些分期系统用于核对许多不同的癌症诊断标志物和癌症症状，以提供对癌症的诊断和/或预后和/或进展的概述。肿瘤学的技术人员将知道如何使用分期系统来评估癌症的诊断和/或预后和/或进展，以及应当使用哪些癌症诊断标志物和癌症症状来进行这种评估。

292、所谓“癌症分期”，包括：rai分期，其包括0期、i期、ii期、iii期和iv期；和/或binet分期，其包括a期、b期和c期；和/或安娜堡分期，其包括i期、ii期、iii期和iv期。

293、已知的是，癌症可以引起细胞形态的异常。这些异常通常可再现地发生在某些癌症中，这意味着在癌症的诊断或预后中可以检查形态的这些变化(又称为组织学检查)。用于使样品可视化以检查细胞形态以及制备用于可视化的样品的技术是本领域众所周知的；例如，光学显微镜或共聚焦显微镜。

294、所谓“组织学检查”，包括：存在小型成熟淋巴细胞，和/或存在具有狭窄细胞质边界的小型成熟淋巴细胞，存在具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞，和/或存在具有狭窄细胞质边界并且具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞，和/或存在非典型细胞和/或裂解细胞和/或幼淋巴细胞。

295、众所周知，癌症是细胞dna突变的结果，所述突变可能导致细胞避免细胞死亡或不可控制地增殖。因此，检查这些突变(也称为细胞遗传学检查)可能是用于评估癌症诊断和/或预后的有用工具。这一点的实例是染色体位置13q14.1缺失，这是慢性淋巴细胞性白血病的特征。用于检查细胞中突变的技术是本领域熟知的；例如，原位荧光杂交技术(fish)。

296、所谓“细胞遗传学检查”，包括检查细胞以及具体地染色体中的dna。细胞遗传学检查可以用于鉴定dna的变化，这些变化可能与难治性癌症和/或复发性癌症的存在相关联。此类变化可以包括：染色体13的长臂中的缺失；和/或染色体位置13q14.1的缺失；和/或染色体12的三体性；和/或染色体12的长臂中的缺失；和/或染色体11的长臂中的缺失；和/或11q的缺失；和/或染色体6的长臂中的缺失；和/或6q的缺失；和/或染色体17的短臂中的缺失；和/或17p缺失；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或抗原基因受体重排；和/或bcl2重排；和/或bcl6重排；和/或t(14:18)易位；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或(3:v)易位；和/或(8:14)易位；和/或(8:v)易位；和/或t(11:14)和(q13:q32)易位。

297、已知的是，患有癌症的受试者表现出某些身体症状，这通常是由于癌症对身体的负担所致。这些症状通常在同一癌症中再次发生，因此可以作为该疾病的诊断和/或预后和/或进展的特征。医学领域的技术人员将理解哪些身体症状与哪些癌症相关联，以及如何评估这些身体系统可以怎样与该疾病的诊断和/或预后和/或进展相关。所谓“身体症状”，包括肝肿大和/或脾肿大。

298、患有“冷”肿瘤的患者不太可能对传统的免疫检查点阻断疗法(例如，施用抗ctla-4抗体或抗pd-1抗体)作出应答。因此，在一些实施方案中，具有冷肿瘤的患者对免疫检查点阻断疗法有耐药性。

299、根据这些观察结果，对icb的抗性构成了未得到满足的重大医疗需求，而可以帮助克服抗性的药物具有巨大的治疗前景。因此，本发明的优点是，能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体的溶瘤病毒与对pd-1和/或pd-l1具有特异性的抗体组合产生了能够克服所述抗性的协同效应，并且靶向以前无法使用免疫检查点抑制剂治疗的冷肿瘤。

300、本发明还涵盖药物组合物，其包含能够表达与ctla-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒和与pd-1和/或pd-l1特异性结合的第二抗体分子的组合，以及与之组合的药学上可接受的载剂和/或稀释剂和/或助剂。此类药学上可接受的载剂、稀释剂和助剂在本领域中是已知的。

301、本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物可以适合于肠胃外施用，其包括水性和/或非水性无菌注射溶液剂，该水性和/或非水性无菌注射溶液剂可以含有抗氧化剂和/或缓冲剂和/或抑菌剂，和/或使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，该水性和/或非水性无菌悬浮液可以包含悬浮剂和/或增稠剂。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿瓶和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(即，冻干)条件下储存，仅需要在临使用前添加无菌液体载剂(例如，注射用水)。

302、可以由前述种类的无菌粉末和/或颗粒和/或片剂制备临时的注射溶液剂和悬浮液。

303、对于人类患者的肠胃外施用而言，以单剂量或分剂量施用的抗pd-1和/或抗pd-l1抗体分子的日剂量水平通常将是1mg/kg患者体重至20mg/kg，或者在一些情况下甚至高达100mg/kg。在一些优选的实施方案中，剂量为10mg/kg。在特殊情况下，例如在结合长期施用的情况下，可以使用较低剂量。在任何情况下，医生都将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且该实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和应答而变化。上述剂量是一般情况的示例。当然，也可能存在个别情况，其中更高或更低的剂量范围是理所应当的，而且此剂量范围处于本发明的范围内。

304、通常，本文所述包含抗体分子的药物组合物(或药物)将含有浓度介于约2mg/ml与150mg/ml之间或介于约2mg/ml与200mg/ml之间的抗pd-1和/或抗pd-l1抗体分子。在一些实施方案中，药物组合物将含有浓度为10mg/ml或25mg/ml的抗pd-1抗体分子和/或抗pd-l1抗体分子。

305、在一些实施方案中，当抗pd-1抗体是派姆单抗时，该抗体以约25mg/ml的剂量使用。在另一些实施方案中，派姆单抗以每3周200mg(iv)的剂量或每6周400mg(iv)的剂量使用。

306、在一些实施方案中，当抗pd-1抗体是纳武单抗时，该抗体以约10mg/ml的剂量使用。在一些实施方案中，纳武单抗以每2周240mg(iv)的剂量或每4周480mg(iv)的剂量使用。在一些实施方案中，纳武单抗可以与抗ctla-4抗体伊匹木单抗结合使用，在这种情况下，纳武单抗以每3周1mg/kg的剂量最多使用4剂，或者以每2周或每3周3mg/kg的剂量使用。

307、在一些实施方案中，当抗pd-l1抗体是阿特珠单抗时，该抗体以约60mg/ml的剂量使用。在另一些实施方案中，阿特珠单抗以每2周840mg(iv)的剂量或每3周1200mg(iv)的剂量或每4周1680mg(iv)的剂量使用。

308、技术人员应当理解，本文所述的任何抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体均能够以其处方信息中所述的任何剂量或给药方案使用。

309、通常，药物组合物(或药物)将含有浓度介于约103至1012vp(病毒颗粒)、iu(感染单位)或pfu(噬菌斑形成单位)之间的本文所述溶瘤病毒，具体浓度取决于病毒和定量技术。样品中存在的pfu的量可以通过计数感染允许细胞(例如cef或vero细胞)以获得噬菌斑形成单位(pfu)滴度后的噬菌斑数量来确定，vp的量可以通过测量260nm吸光度来确定，并且iu的量可以通过定量免疫荧光(例如使用抗病毒抗体)来确定。作为一般指导，适用于包含溶瘤痘病毒的药物组合物的单独剂量在以下范围内：约103pfu至约1010pfu，有利地为约103pfu至约109pfu，优选地为约104pfu至约107pfu；并且更优选地为约106pfu至约107pfu。

310、在一些实施方案中，当受试者是小鼠时，溶瘤病毒的最佳剂量为约106pfu至107pfu。在一些实施方案中，当受试者是人时，溶瘤病毒的最佳剂量为约106pfu至109pfu。

311、通常，在人类中，口服或肠胃外施用本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物是最方便的优选途径。对于兽医用途，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物根据正常兽医实践，以适当可接受的制剂施用，并且兽医将确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了包含一定量的对于治疗各种病况(如上文和下文进一步描述的)有效的本发明的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞的药物制剂。

312、优选地，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物适于通过选自包括以下项的组的途径来递送：静脉内、瘤内、肌内、皮下。施用可以是单次注射或几次重复注射的形式(例如，在相同或不同的施用部位处，以相同或不同的剂量，用相同或不同的途径)。出于说明的目的，包括约104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109或1010pfu的溶瘤痘病毒(例如，本文所述的tk和rr缺陷性痘苗病毒)的单独剂量特别适合于瘤内施用。

313、本发明还包括本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物，该药物组合物包含本发明的多肽结合部分的药学上可接受的酸或碱加成盐。用于制备可用于本发明的前述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的那些酸，这些无毒酸加成盐即含有药理学上可接受的阴离子的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸酯)]盐，等等。也可以使用药学上可接受的碱加成盐来产生药学上可接受的盐形式的根据本发明的药剂。可以用作试剂以制备在性质上为酸性的本发明药剂的药学上可接受的碱盐的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的那些。此类无毒碱盐包括但不限于：衍生自此类药学上可接受的阳离子的碱盐，诸如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)的碱盐；铵或水溶性胺加成盐，诸如n-甲基葡糖胺-(葡甲胺)；以及低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其他碱盐，等等。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞在使用前，可以冻干以储存并在合适的载剂中重构。可以采用任何合适的冻干方法(例如，喷雾干燥、滤饼干燥)和/或复溶技术。本领域的技术人员应当理解，冻干和复溶可能导致不同程度的抗体活性损失(例如，对于常规免疫球蛋白，igm抗体往往比igg抗体具有更大的活性损失)，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。在一个实施方案中，冻干的(冷冻干燥的)多肽结合部分在重新水合时，其(冻干之前的)活性损失不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。

314、在一些实施方案中，将病毒组合物适当地在生理ph或略微碱性的ph处缓冲(例如，从约ph 7至约ph 9，且特别优选的是，ph介于7与8.5之间，更具体地接近8)。在病毒组合物中还包含单价盐以确保适当的渗透压可能是有益的。所述单价盐尤其可以选自nacl和kcl，优选地，所述单价盐是nacl，优选地浓度为10至500mm(例如50mm)。合适的病毒组合物包括50g/l的蔗糖、50mm的nacl、10mm的tris-hcl和10mm的ph8的谷氨酸钠。还可以配制组合物以便包含用于在低储存温度下保护溶瘤病毒的冷冻保护剂。合适的冷冻保护剂包含但不限于蔗糖(或蔗精)、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油，优选浓度为0.5％至20％(以g计重量/以l计体积，称为w/v)，以及高分子量聚合物，如右旋糖酐或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。

315、应当理解，如本文所述的包含能够表达第一抗体分子的溶瘤病毒的组合物和包含第二抗体分子的组合物可以作为单一组合物在同一时间(即，同时)施用。

316、替代性地，这些组合物可以在相似的时间或在不同的时间点(例如，间隔一天或一周)分别施用。例如，溶瘤病毒可以在第二抗体分子之前施用。在其他实例中，第二抗体分子可以在溶瘤病毒之前施用。这种依次施用可以通过暂时分离溶瘤病毒和第二抗体分子来实现。替代性地，或与第一选项组合，依次施用也可以通过以下方式来实现：在空间上分离溶瘤病毒和第二抗体分子；以某种方式(诸如瘤内)施用能够表达抗ctla-4抗体的溶瘤病毒，使得其在第二抗体分子之前到达癌症，然后以某种方式(诸如全身性)施用该第二抗体分子，以便其在溶瘤病毒之后到达癌症。

317、如上所述，本发明的溶瘤病毒和第二抗体分子可以根据每种组分的已建立治疗方案来施用。这意味着每种组分的施用可以在同一时间进行，或者在相对于彼此不同的时间进行。

318、在一些实施方案中，可以重复施用如本文所述的能够表达第一抗体分子的溶瘤病毒，以及第二抗体分子。例如，施用可以重复两次、三次、四次、五次，或达到治疗效果所必需的多次。

319、现在将参考以下附图和实施例来描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实例：