一种富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物及其制备方法和应用

本发明属于天然防腐剂，具体涉及一种富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物及其制备方法以及在制备具有抑制食源性腐败菌作用的产品中的应用。

背景技术：

1、微生物污染是食品腐败变质的主要原因，不仅会造成巨大的经济损失，食源性腐败菌产生的毒素还会对人体健康产生威胁，是导致食品安全事故的主要原因。为防止微生物污染，在食品加工过程中，通常会加入防腐剂。目前，我国食品工业解决食品腐败问题主要依靠化学食品防腐剂，如亚硝酸盐、山梨酸、苯甲酸及其盐类等，但化学食品防腐剂存在潜在危害，尤其是过量使用化学防腐剂具有食物中毒、致癌等安全问题，因此，开发天然抑菌活性物质以取代化学防腐剂具有重要意义。

2、油茶为山茶科山茶属多年生木本油料作物，是我国主要经济林树种之一，它和油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本食用油料作物。油茶籽经浸出或压榨可得到茶油，茶油不仅色、香、味俱佳，而且还具有预防和治疗高血压、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的功效。油茶粕是油茶籽被榨取食用油后剩下的副产物，近年来，随着茶油需求量和产出量的增加，副产物油茶粕也逐年增加。

3、油茶粕中含有茶皂素、蛋白质、多糖等多种功能有效成分。茶皂素作为天然优良的表面活性剂，不仅发泡、乳化作用较强，还具有抑菌、消炎、镇痛、抗癌等生理活性，其中，尤以抑菌作用最为显著；同时，油茶粕中的蛋白质经水解可制备具有抗菌活性的活性肽，即油茶粕抗菌肽。茶皂素与油茶粕抗菌肽均是良好的天然抑菌剂，但对细菌、霉菌、酵母的抑制作用各有强弱，各自的广谱抑菌效果不强。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物，该油茶粕提取物富含抗菌肽和茶皂素，集成了油茶粕和茶皂素抗菌肽各自的抑菌优势，对食源性腐败菌具有广谱抑菌活性。

2、本发明的目的之二在于提供一种上述富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物的制备方法，该方法采用连续制备的方法，一方面水解油茶粕蛋白获取抗菌肽，另一方面从油茶粕中提取茶皂素。

3、本发明的最后一个目的在于提供上述富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物在制备具有抑制食源性腐败菌作用的产品中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物的制备方法，包括以下步骤：

5、（1）、油茶粕预处理：将油茶粕进行热压、蒸汽爆破及混合酶解预处理；

6、（1.1）热压预处理：以生产茶油的副产物油茶粕为原料，将油茶粕粉碎后置于高压灭菌设备中，在温度115~121℃下进行热压处理15~20min；

7、（1.2）蒸汽爆破预处理：将经过热压预处理的油茶粕粉置于蒸汽爆破设备中，利用饱和水蒸气进行爆破处理，调节蒸汽爆破压强1.2~1.4mpa，处理时间为40~50s，达到处理时间后，瞬间减压完成物料爆破，得到结构松散的油茶粕粉；

8、（1.3）混合酶解预处理：将结构松散的油茶粕粉置于容器中，加入水，在水-油茶粕体系原始ph 值6.0~6.5条件下，加入木聚糖酶、半纤维素酶及纤维素酶，随后置于40～50℃水浴中水解120～150min，得酶解液；

9、（2）、油茶粕预处理完成后，调节酶解液ph值，达到油茶粕蛋白的等电点，使蛋白质的沉淀量最大，完成后进行离心分离，分别收集上清液、蛋白质沉降物，其中，上清液用于提取茶皂素、蛋白质沉降物用于制备油茶粕抗菌肽；

10、（3）、取步骤（2）得到的蛋白质沉降物，加入水并搅匀，调节ph值8.0～8.5，添加含碱性蛋白酶和胰蛋白酶的复合蛋白酶，随后置于40～50℃水浴中水解150～210min，完成复合蛋白酶水解后，进行离心分离，收集上清液，将上清液通过膜分离设备进行膜过滤，膜分离完成后，收集透过液，即得到抗菌肽制备液，经低温真空干燥，得到抗菌肽制备物；

11、（4）、取步骤（2）所得的上清液，加入装有ab-8 大孔树脂的层析柱中，待上清液在层析柱中完成吸附后，首先以蒸馏水洗脱吸附在大孔树脂中的可溶性糖，水洗至洗脱液呈中性且经蒽酮-硫酸法检测不存在糖类，随后以低浓度乙醇水溶液洗脱吸附在大孔树脂中的多酚，至洗脱液经福林酚法检测不存在多酚，再以高浓度乙醇水溶液对吸附于大孔树脂中的茶皂素进行洗脱，收集全部茶皂素洗脱液后蒸馏出乙醇，得到茶皂素水提浓缩液，将茶皂素水提浓缩液进行低温真空干燥，得到茶皂素制备物；

12、（5）、分别取步骤（3）得到的抗菌肽制备物与步骤（4）得到的茶皂素制备物，按照其中有效成分抗菌肽与茶皂素的质量份配比为30~70∶20~60进行复配并混匀，即得到抑制食源性腐败菌的富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物。

13、本发明采用连续制备的方法，一方面水解油茶粕蛋白获取抗菌肽，另一方面从油茶粕中提取茶皂素，将油茶粕抗菌肽与茶皂素制备物以恰当比例配合，可制备得到一种富含抗菌肽与茶皂素的具有广谱抑菌活性、可有效抑制食源性腐败菌的油茶粕提取物，可用于开发绿色天然食品防腐剂，并为油茶粕的高值化利用提供新途径。

14、在上述富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物的制备方法中：

15、可选地，步骤（1.3）中水的加入量为油茶粕粉总质量的8~12倍。

16、根据油茶粕中木质素含量高于半纤维素、半纤维素含量高于及纤维素的具体情况，可选地，步骤（1.3）中所述木聚糖酶、半纤维素酶及纤维素酶的用量分别为15.0~20.0u/g油茶粕、9.0~12.0u/g油茶粕及5.0~8.0 u/g 油茶粕。

17、可选地，步骤（2）中以0.5～1.0mol/l的盐酸溶液调节酶解液ph值为4.6，达到油茶粕蛋白的等电点pi 4.6。

18、可选地，步骤（3）中水的加入量为蛋白质沉降物总质量的8~10倍。

19、可选地，步骤（3）中以1.0～1.5mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值8.0～8.5。

20、可选地，步骤（3）中所述复合蛋白酶的添加量为总酶活5500～6000 u/g蛋白质沉降物。

21、可选地，步骤（3）中所述复合蛋白酶中碱性蛋白酶与胰蛋白酶的酶活比为3∶2。

22、可选地，步骤（3）中步骤（3）中膜过滤参数为：压力1.5～2kg/cm2，透过量为30～35ml/min，透过分子量3000da。

23、可选地，步骤（3）中所得抗菌肽制备物，经三氯乙酸沉淀法测定，其中抗菌肽含量达到90%以上，经凝胶色谱法测定，所述抗菌肽制备物以分子量1000 da以下短肽为主，主要是由3~8个氨基酸构成的小肽，小肽含量达到70%以上。

24、本发明步骤（4）中取上述步骤（2）得到的上清液用于提取茶皂素，鉴于油茶粕中的蛋白质被沉降，木质素、半纤维素及纤维素被酶解为可溶性低聚糖及小分子糖，此上清液中主要成分为茶皂素、可溶性糖及多酚，因此，脱除其中的可溶性糖及多酚，可以达到去除杂质的目的，得到以茶皂素为主要成分的制备物。

25、可选地，步骤（4）中按照上清液体积与ab-8 大孔树脂湿树脂质量的比例为25~30ml∶1g添加上清液，上样流速为3.0~4.0 ml/min。

26、鉴于此上清液样液中三类主要成分的极性排序为：可溶性糖极性最大、多酚极性次之、茶皂素极性最小，可分别采用水、低浓度乙醇以及高浓度乙醇进行洗脱。因此，首先以蒸馏水进行洗脱吸附在大孔树脂中的可溶性糖，水洗至洗脱液呈中性且经蒽酮-硫酸法检测不存在糖类；随后以20%（体积百分含量）乙醇溶液洗脱吸附在大孔树脂中的多酚，至洗脱液经福林酚法检测不存在多酚；再以75~85%（体积百分含量）乙醇溶液对吸附于大孔树脂中的茶皂素进行洗脱，洗脱液75~85%乙醇溶液和上清液上样液的体积比为1.5~2∶1，洗脱液的流速为2.0~3.0 ml/min，收集全部茶皂素洗脱液后经旋转蒸发仪蒸馏出乙醇，得到茶皂素水提浓缩液。

27、可选地，步骤（4）中所述低浓度乙醇水溶液的体积百分含量为20%。

28、可选地，步骤（4）中所述高浓度乙醇水溶液的体积百分含量为75~85%，所述高浓度乙醇水溶液与所述上清液的体积比为1.5~2∶1。

29、可选地，步骤（4）中所述洗脱液的流速为2.0~3.0 ml/min。

30、可选地，步骤（4）中所述茶皂素制备物，经分光光度法测定，其中茶皂素含量达到90%以上。

31、可选地，步骤（3）~步骤（4）中低温真空干燥的温度为4~10℃。

32、进一步地，步骤（5）中按照抗菌肽与茶皂素的质量份配比为2∶1进行复配并混匀，即得到一种有效抑制食源性腐败菌的富含抗菌肽与茶皂素的油茶粕提取物。

33、本发明具有以下有益效果：

34、（1）本发明采用连续制备的方法，将蛋白质从油茶粕中沉降出来制备抗菌肽，利用沉降蛋白质后的溶液提取茶皂素，不仅获取了抗菌肽，同时也从油茶粕中提取茶皂素，相较于只利用油茶粕制备抗菌肽或者提取茶皂素的传统单一综合利用技术，本发明对油茶粕的综合利用更加充分，资源利用效率更高；

35、（2）油茶粕抗菌肽与茶皂素均是良好的天然抑菌剂，但对细菌、霉菌、酵母等不同食品腐败菌的抑制作用各有强弱，抗菌肽通过与食品腐败菌的细胞壁和细胞膜相互作用，增加细胞膜通透性使细胞内的物质流出，从而达到杀死食品腐败菌的效果；茶皂素的表面活性作用改变了食品腐败菌细胞膜的通透性，进而破坏细胞内构造和酶系统，同时，茶皂素水解后产生的有机酸使细胞内液酸化，破坏各细胞器的正常功能与代谢，达到杀死食品腐败菌的效果，本发明将油茶粕抗菌肽与茶皂素以恰当比例配合，利用抗菌肽与茶皂素的抑菌协同作用，制备得到一种富含抗菌肽与茶皂素的具有广谱抑菌活性、可有效抑制食源性腐败菌的油茶粕提取物，可用于开发绿色天然食品防腐剂；

36、（3）本发明在制备抗菌肽及茶皂素之前，对油茶粕采用了热压、蒸汽爆破及混合酶预处理，油茶粕蛋白质在热压过程中发生了变性作用，变性后，空间结构遭破坏，使氨基酸充分暴露，可提高酶解制备抗菌肽的效率；同时，热压、蒸汽爆破及混合酶预处理也有效破坏了油茶粕中木质素、半纤维素及纤维素的空间结构及分子结构，促进了包裹于其中的蛋白质及茶皂素释放，因此提高了抗菌肽及茶皂素的制备效率，进一步提升油茶粕资源利用效率。