递送DNAzyme的锰基仿病毒药物递送系统及制备方法和应用

本发明属于药物制剂，涉及一种递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统及制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤发生脑转移导致了五分之一癌症患者的死亡，且脑转移患者的中位生存期仅4个月。受限于脑转移独特的生理病理环境，三阴性乳腺癌脑转移患者并不能从现有的治疗方案中获益。此外，放化疗的介入往往导致显著的不良反应，患者生存质量较差。随着诊断技术的进步和原发肿瘤治疗结果的改善，脑转移的发病率不断增加。因此，迫切需要开发具有低毒性的有效治疗手段来缓解脑转移的治疗困境。

2、免疫疗法已经为多种癌症的治疗带来了曙光，但三阴性乳腺癌免疫原性极低，加之中枢神经系统对药物和免疫细胞的限制，最终使得脑转移患者在免疫疗法的临床试验中被排除。然而仿病毒纳米递送系统可以根据特定的需求进行设计，在避免潜在遗传风险的前提下模拟病毒的连续感染过程。具体地，仿病毒纳米递送系统可以保持病毒的免疫逃逸和组织趋向性特性以实现药物的有效递送。同时，仿病毒纳米递送系统可以模拟病毒的感染过程实现cgas-sting通路的激活，进而诱发先天免疫。仿病毒系统通过激活先天免疫实现对肿瘤的抑制已经在4t1小鼠原位模型中得到了证实。先天免疫的激活有助于适应性免疫应答的启动以及随后t细胞的浸润，通过免疫原性细胞死亡诱导免疫激活以增加t细胞在脑转移灶的浸润已经证实可以抑制转移的进展。但强大的免疫抑制转移微环境会在很大程度上引起治疗抵抗，尚未能将仿病毒纳米递送系统有效应用到脑转移肿瘤的治疗中。在乳腺癌脑转移的过程中，星形胶质细胞分泌含有mir 19a的外泌体，通过表观遗传可逆的下调转移细胞pten的表达，进而激活stat3介导肿瘤的免疫逃逸和免疫抑制环境的形成。通过靶向降解mir 19a可以挽救转移细胞pten的丢失并重塑免疫抑制的微环境，进而实现对乳腺癌脑转移的抑制。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供了一种递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统及制备方法和应用，尤其涉及一种同时激活先天免疫、适应性免疫和改善免疫抑制微环境的靶向控释型仿病毒纳米药物。本发明基于cgas-sting激活和mir 19a靶向降解的免疫激活和微环境调控，在激活先天免疫、适应性免疫的同时改善免疫抑制的微环境，在无化疗药物辅助的条件下抑制脑转移进展，显著延长脑转移模型小鼠的生存期，用于乳腺癌脑转移治疗。本发明的技术方案如下：

2、用于乳腺癌脑转移治疗的递送dnazyme的锰基仿病毒纳米药物递送系统，其组成成分包括负载dnazyme的空心二氧化锰、掺杂脂质的红细胞膜的混合膜、 d-cskc肽和ha2肽。

3、上述锰基仿病毒纳米药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）将聚乙二醇辛基苯基醚（曲拉通x-100）、环己烷、正己醇在烧瓶中混匀后快速加入氨水和水，搅拌均匀，然后加入硅酸乙酯和3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下搅拌反应，离心，用乙醇和去离子水清洗，干燥并收集得到表面改性的二氧化硅；

5、（2）将表面改性的二氧化硅使用去离子水溶解，滴加高锰酸钾水溶液后室温下搅拌反应，离心后取沉淀溶解于碳酸钠溶液中，于60 ℃的油浴中搅拌，离心后用去离子水清洗即得空心二氧化锰；

6、（3）将磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺（dspe-peg-mal）和 d-csks肽分别溶解于n,n-二甲基甲酰胺（dmf）-水的混合溶液，获得dspe-peg-mal溶液和 d-cskc溶液；其中，dspe-peg-mal溶液的浓度为10 mg/ml，所述 d-csks肽溶液的浓度为10 mg/ml；

7、（4）将dspe-peg-mal溶液滴加至 d-cskc肽溶液中，室温下反应后透析，冷冻干燥，得到白色松软固体，即dspe-peg-csks；使用相同方法制备dspe-peg-ha2，其中，dspe-peg-mal溶液的浓度为10 mg/ml，ha2肽溶液的浓度为10 mg/ml；

8、（5）将dnazyme与步骤（2）获得的空心二氧化锰在室温下孵育，得到负载dnazyme的空心二氧化锰；

9、（6）将磷脂与红细胞膜混合，超声后得到掺杂脂质的红细胞膜的混合膜；

10、（7）将混合膜和负载dnazyme的空心二氧化锰混合后在4 ℃条件下进行超声，离心后保留沉淀物；

11、（8）取步骤（7）获得的沉淀物重新在去离子水中溶解后与dspe-peg-csks、dspe-peg-ha2混合，在4 ℃的条件下孵育，离心后即得递送dnazyme的锰基仿病毒纳米药物递送系统。

12、优选的，所述步骤（1）中曲拉通x-100、环己烷、正己醇的体积比为53:225:54，硅酸乙酯和3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比为5:2，搅拌反应时间为12~15 h，离心转速为13000 rpm，离心时间为10min。

13、优选的，所述步骤（2）中表面改性的二氧化硅溶液浓度为1 mg/ml，高锰酸钾浓度为10 mg/ml，表面改性的二氧化硅溶液与高锰酸钾溶液的体积比为4:3，反应时间为6 h，离心转速为12000 rpm，离心时间为25 min。

14、优选的，所述步骤（3）中于dmf-水混合溶液中dmf和水的体积比为1:1。

15、优选的，所述步骤（4）中dspe-peg-mal溶液与 d-cskc肽溶液的体积比为1:1，反应时间为12 h，透析时间为12 h；dspe-peg-mal溶液与ha2肽溶液的体积比为1:1，反应时间为12 h，透析时间为12 h。

16、优选的，所述步骤（5）中空心二氧化锰与dnazyme的质量比为5:1，孵育时间为0.5h。

17、优选的，所述步骤（6）中磷脂与红细胞膜蛋白的质量比为3:2。

18、优选的，所述步骤（7）中混合膜与负载dnazyme的空心二氧化锰的质量比为1:4。

19、优选的，所述步骤（8）中沉淀物与dspe-peg-csks、dspe-peg-ha2的质量比为30:1:1，孵育时间为6 h。

20、本发明还包括递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统在制备用于治疗乳腺癌脑转移药物中的应用，以及由上述制备方法获得的递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统在制备用于治疗乳腺癌脑转移药物中的应用。

21、本发明中递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统通过超声法包膜，通过dspe与膜进行锚定以定量修饰ha2和d型cskc肽。

22、本发明递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统中空心二氧化锰的刺激释放因素为肿瘤细胞胞内的高还原环境，响应释放后变为mn2+激活cgas-sting通路，并辅助dnazyme发挥特异的rna切割作用。

23、本发明中，采用共孵育和超声的方法构建了具有三重免疫调控能力的锰基仿病毒纳米药物。负载dnazyme的空心二氧化锰模拟病毒基因组用于mir 19a的特异性降解和cgas-sting的激活。混合膜模拟病毒的核衣壳用于延长药物的血液循环时间并保护dnazyme不受破坏。 d-cskc肽和ha2肽通过模拟病毒尖峰的作用促进血脑屏障穿透和转移灶靶向，并介导迅速的内体溶酶体逃逸，确保dnazyme的活性。三阴性乳腺癌脑转移模型小鼠的药效学结果表明，该锰基仿病毒纳米药物递送系统可以实现药物的转移瘤富集，挽救pten丢失，促进免疫细胞的浸润并抑制stat3的激活。最终，通过同时激活先天免疫、适应性免疫和改善免疫抑制的微环境，在无化疗药物辅助条件下抑制脑转移进展，显著延长脑转移模型小鼠的生存期。

24、相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

25、（1）本发明获得的锰基仿病毒纳米药物递送系统构成原料包括负载dnazyme的空心二氧化锰、掺杂脂质的红细胞膜的混合膜、 d-cskc肽和ha2肽等，在体内降解后不会对机体产生明显毒性。

26、（2）与单一化疗策略相比，本发明可实现药物的转移瘤有效富集，实现药物的精确打靶，在无化疗药物辅助条件下提高疗效并降低系统毒性。

27、（3）本发明中递送dnazyme的锰基仿病毒药物递送系统通过挽救pten丢失，促进免疫细胞的浸润并抑制stat3的激活。在无化疗药物辅助条件下激活先天免疫、适应性免疫应答并改善免疫抑制的微环境，产生增强的协同抗肿瘤功效，因此具有较好的临床转化前景。