抗HIV-1的重组蛋白及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一种融合蛋白，更具体地，涉及一种抗hiv-1的重组蛋白及其应用。

背景技术：

1、人类获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，aids)，简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus，hiv)感染而引起。

2、迄今为止，hiv-1的疫苗研究均以失败告终。对hiv-1的药物治疗早期比较重要的成果是鸡尾酒疗法(highly active antiretroviraltherapy，haart)。持续性的鸡尾酒疗法，使得hiv-1感染者体内的病毒载量长期维持在一个低水平，但并不能清除病毒，病人需要长期服用药物，hiv-1感染者以及aids患者使用此类药物后会产生严重而复杂的副作用，而且长期服药又会导致hiv-1耐药株的产生。虽然hiv-1广谱中和抗体(bnabs)也可以抑制多种hiv-1毒株感染宿主，近年来已被作为药物候选物进行临床前或临床实验，但是其费用十分昂贵，即使成功也难以大范围使用。目前抗hiv-1药物，如逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂等，多为化学类药物。生物类药物具有毒性小、可在病人体内实现持续或可控表达的优势，但目前用于临床的生物类药物及其匮乏，且仍然存在广谱性较差、抑制效果欠佳、副作用大以及存在抗性毒株等问题。

3、本领域需要一种产品，其抑制hiv-1的广谱性和抑制效果好，且用法安全。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种重组蛋白，包括：

2、1)cd4的d1d2(结构域1结构域2)结构域；

3、2)dc-sign的nd(颈结构域)和crd(碳水化合物识别结构域)；以及

4、3)igg1 fc段。

5、进一步地，所述重组蛋白从n端到c端依次为1)、2)、3)，或者1)、3)、2)，或者3)、1)、2)，或者3)、2)、1)，或者2)、1)、3)，或者2)、3)、1)。

6、进一步地，所述重组蛋白优选从n端到c端依次为1)、2)、3)，或者1)、3)、2)。

7、进一步地，所述重组蛋白更优选从n端到c端依次为1)、3)、2)。

8、进一步地，所述重组蛋白还包括不同的种类和长度的linker。

9、在一些具体的实施方案中，所述linker可以是(g4s)n、aadp、(eaaak)n、kesgsvsseqlaqfrsld、egkssgsgseskst等

10、进一步地，cd4的d1d2结构域的序列为：

11、kkvvlgkkgdtveltctasqkksiqfhwknsnqikilgnqgsfltkgpsklndradsrrslwdqgnfpliiknlkiedsdtyicevedqkeevqllvfgltansdthllqgqsltltlesppgsspsvqcrsprgkniqgektlsvsqlelqdsgtwtctvlqnqkkvefkidivvla。

12、进一步地，dc-sign的nd和crd的序列为：

13、vgelseksklqeiyqeltqlkaavgelpeksklqeiyqeltrlkaavgelpeksklqeiyqeltwlkaavgelpekskmqeiyqeltrlkaavgelpekskqqeiyqeltrlkaavgelpekskqqeiyqeltrlkaavgelpekskqqeiyqeltqlkaaverlchpcpwewtffqgncyfmsnsqrnwhdsitackevgaqlvviksaeeqnflqlqssrsnrftwmglsdlnqegtwqwvdgspllpsfkqywnrgepnnvgeedcaefsgngwnddkcnlakfwickksaascsrdeeqflspapatpnpppa。

14、进一步地，igg1 fc段的序列为：

15、epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

16、使用本发明所述的重组蛋白，对hiv-1具有显著的抑制效果，且用法安全。

17、在一些具体的实施方案中，所述重组蛋白为如seq id no.1～4所示的蛋白。

18、在一些优选的实施方案中，所述重组蛋白为如seq id no.2～4所示的蛋白。

19、使用上述的重组蛋白，对hiv-1的抑制效果更佳，具有很好的广谱性。

20、在一些更优选的实施方案中，所述重组蛋白为如seq id no.2～3所示的蛋白。

21、使用这些重组蛋白，对hiv-1的抑制效果最佳，且具有更佳的广谱性，对很对hiv-1的早期毒株也有很好的抑制效果。

22、在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的重组蛋白的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的重组蛋白。

23、在一些具体的实施方案中，所述核酸分子为如seq id no.5～8所示的核酸。

24、在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。

25、在某些优选的实施方案中，所述载体包含编码本发明重组蛋白的核苷酸序列。

26、在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，病毒等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的重组蛋白。

27、在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。

28、此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。

29、在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如cho(例如cho-k1、cho-s、cho dg44)或hek293。

30、在另一个方面，本发明提供了制备本发明的重组蛋白的方法，其包括，在允许所述重组蛋白表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述重组蛋白。

31、在某些优选的实施方案中，所述方法包括：

32、1)构建包含编码本发明重组蛋白的核苷酸序列的表达载体；

33、2)将步骤1)中所述的表达载体转化至宿主细胞；

34、3)在允许本发明的重组蛋白表达的条件下，培养步骤2)中所述的宿主细胞；和

35、4)从培养的宿主细胞培养物中回收所述重组蛋白。

36、在另一个方面，本发明提供了本发明所述的重组蛋白在制备抗hiv-1感染的药物中的用途。

37、在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

38、本发明的重组蛋白或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。

39、优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。

40、此外，本发明的重组蛋白可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。在某些实施方案中，所述单位剂量为至少0.1mg，1mg，至少5mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg，或至少100mg。在所述药物组合物为液体(例如，注射剂)剂型的情况下，其可以包含浓度至少为0.1mg/ml，如至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml，至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml，或至少100mg/ml的本发明的重组蛋白。

41、本发明的重组蛋白或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白或药物组合物通过静脉输注或注射给予。

42、在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。

43、本发明所提供的药物组合物或重组蛋白可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如病毒抑制剂)联合使用。在某些优选的实施方案中，将本发明的重组蛋白与其它hiv-1抑制剂联合使用，以预防和/或治疗hiv-1感染。

44、本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的重组蛋白。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如进展为艾滋病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的重组蛋白的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

45、因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的重组蛋白。