一种HPLC测定阿加曲班原料药中杂质C的检测方法与流程

本发明提供了一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，属于药品分析检测领域。该方法针对阿加曲班中杂质c进行高效、准确的定量分析，为阿加曲班原料药的质量控制提供有力支持。

背景技术：

1、阿加曲班作为一种凝血酶抑制剂，属于合成低分子左旋精氨酸衍生物，可以选择性作用在凝血酶活性点上，通过对凝血酶的催化与诱导过程进行干扰，达到抗血凝效果。并且，阿加曲班还能够抑制微血栓中的凝血酶，对人体的凝血功能进一步调节，继而帮助患者改善其脑部的血液循环，防治血栓形成。

2、原料药中杂质检查是其质量控制最主要的指标之一，其中杂质的研究更是原料药研发的一项重要内容。它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。所以规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，准确的测定其残留量，将直接关系到上市药品的质量及安全性。

3、阿加曲班原料药在制备、储存过程中会残留中间体、产生副产物及降解出杂质，本品有3个手性中心会产生多个非对映异构体及对映异构体。可能产生的杂质为：杂质a、杂质b、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质j、杂质k、杂质lrs、杂质lsr、杂质lss及杂质c，这些杂质均为阿加曲班原料药中所控制的有关物质。其中阿加曲班和杂质c分别为分子结构中四氢喹啉环3位碳上的r和s异构(见图1、图2)，目前阿加曲班检测方法已收录至美国药典及日本药典中，日本药典中没有杂质c的控制，美国药典中收载有杂质c的检测。采用美国药典反相液相色谱条件，阿加曲班及杂质c均出两个峰，其中杂质c的后一个峰与阿加曲班前一个峰重叠，方法专属性存在问题，杂质定量时不准确，不能准确测定出阿加曲班中杂质c的含量。阿加曲班与杂质c极性相近，通过大量的试验均不能有效分离。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法。其能够有效地对阿加曲班原料药中杂质c进行定量检测。且通过考察流动相a中盐溶液的浓度、ph、不同的洗脱程序有效提高检测的灵敏度，该检测方法可以客观、简便、准确的评价阿加曲班原料药中杂质c中的质量，保证临床用药安全性。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，包括以下步骤：

4、步骤1：配制系统适用性溶液：取杂质c及阿加曲班对照品适量，用溶剂稀释，作为系统适用性溶液；以系统适用性溶液检测分离条件及理论板数，其中杂质c峰与其相邻峰的分离度应不小于1.5，理论板数按杂质c峰计算应不低于5000；

5、步骤2：配制供试品溶液：取阿加曲班原料药适量，用溶剂稀释，作为供试品溶液；

6、步骤3：配制对照品溶液：取杂质c对照品适量，用溶剂稀释，作为对照品溶液；

7、步骤4：以合格的色谱分离条件获取供试品溶液和对照品溶液的色谱图，并通过外标法确定阿加曲班中杂质c的含量；

8、上述步骤1的一些实施方案中，系统适用性溶液的配制为：取阿加曲班对照品、杂质c对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含阿加曲班4mg，杂质c 4μg的溶液，作为系统适用性溶液；

9、上述步骤2的一些实施方案中，供试品溶液的配制为：取阿加曲班原料药适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含阿加曲班4mg的溶液，作为供试品溶液；

10、上述步骤3的一些实施方案中，对照品溶液的配制为：取杂质c对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含杂质c 4μg的溶液，作为对照品溶液；

11、在本发明的一些实施方案中，上述步骤1、步骤2和步骤3中所述的溶剂为乙腈-水80：20。

12、上述步骤4中，液相色谱法的色谱条件如下：色谱柱为硅胶填充色谱柱，以乙酸铵水溶液和乙腈为流动相，采用梯度洗脱方式。

13、进一步的，所述步骤4中，液相色谱检测的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为：乙酸铵溶液，其中乙酸铵的浓度为0.08～0.2mol/l，优选为0.1mol/l；用氨水调节ph为为7.3～7.7，优选为7.5；所述流动相b为乙腈；

14、进一步的，所述步骤4中，液相色谱检测的流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.6ml/min；柱温为35～45℃，优选为40℃；检测波长为250～265nm，优选为259nm。

15、进一步的，所述步骤4中，液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱，所述梯度洗脱的具体流程如下：0～5min，流动相a15％→15％；5～30min，流动相a15％→25％；30～31min，流动相a 25％→15％；31～45min，流动相a15％→15％。

16、本发明与现有技术相比具有的有益效果是：

17、本发明的一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法能够对阿加曲班中杂质c进行检测，具有专属性强、灵敏度高、精密度好等优点，保证了阿加曲班原料药的质量、提高临床用药的安全性。

技术特征：

1.一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，该方法包括样品的预处理、流动相的选择与优化、以及特定条件下的色谱分析，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，其特征在于，所述液相色谱法检测的色谱柱为硅胶(silica)为填充剂。

3.根据权利要求1所述的一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为0.1mol/l乙酸铵水溶液，其中ph用氨水调节为7.3～7.7；所述流动相b为乙腈。

4.根据权利要求1所述一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的流动相的流速为0.3～1.0ml/min，柱温为35～45℃。

5.根据权利要求1所述的一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的检测波长为250～265nm。

6.根据权利要求5述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的检测波长为259nm。上述特定波长选择能够进一步提高检测的准确度。

7.根据权利要求1所述的一种hplc测定阿加曲班原料药中杂质c的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱，所述梯度洗脱的具体流程如下：0～5min，流动相a15％→15％；5～30min，流动相a15％→25％；30～31min，流动相a 25％→15％；31～45min，流动相a15％→15％。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的检测方法能够有效地将杂质c峰与其相邻杂质峰进行区分，有效提高了检测的分离度。

技术总结本发明提供了一种HPLC法测定阿加曲班原料药中杂质C的检测方法，涉及药物分析领域，包括：使用硅胶填充色谱柱，以乙酸铵水溶液和乙腈为流动相，采用梯度洗脱方式对杂质C进行分析检测；取杂质C及阿加曲班对照品适量，制备系统适用性溶液，以系统适用性溶液检测分离条件及理论板数，杂质C峰与其相邻峰的分离度应不小于1.5，理论板数按杂质C峰计应不低于5000；取阿加曲班原料药适量，制备供试品溶液；取杂质C适量，制备对照品溶液；通过外标法进行杂质测定，实现了阿加曲班原料药中杂质C的定量检测，该测定方法分离度好、专属性强、灵敏度高、准确度高，对于阿加曲班原料药中杂质C的准确定量具有重要的现实意义。技术研发人员：吕振培,王慧菊,秦丽华,耿志景受保护的技术使用者：新乡双鹭药业有限公司技术研发日：技术公布日：2024/7/23