一种基于调节发酵环境氨态氮含量的淡豆豉发酵炮制方法与流程

本发明属于中药材炮制，具体涉及一种基于调节发酵环境氨态氮含量的淡豆豉发酵炮制方法。

背景技术：

1、大豆，学名glycine max，又叫黄豆、青仁乌豆、泥豆、马料豆等，属于豆科草本植物，在古代称之为“菽”。其蛋白质含量较高，是中国最重要的粮食作物之一，我国大豆产量约占世界总产量的十分之一，可达1730万吨/年-2000万吨/年左右，被称为“大豆之王”。大豆本身的营养价值很高，被美誉为“豆中之王”“田中之肉”“绿色的牛乳”，甚至被誉为拯救人类和地球的最佳食品。发酵后的豆制品，不仅营养更丰富同时更易被人体所吸收，使人体对其蛋白质和矿物质的吸收率大大提高，可高达92％～96％。

2、淡豆豉(sojae semen praeparatum)又叫香豉(出自《伤寒论》)、淡豉(出自《本草纲目》)、豆豉(出自《普济本事方》)、豉(出自《范汪方》)，为豆科大豆属植物大豆(glycinemax(l.)merr.)的成熟种子与桑叶、青蒿一起经发酵加工制成。自梁代以来，淡豆豉一直在临床上广泛应用。淡豆豉在古方中多用于治疗伤寒、头痛、寒热、瘴气、恶毒及满闷诸证。

3、淡豆豉是以大豆为主料，以青蒿、桑叶等为辅料经过发酵加工而成的制品。卫生部规定淡豆豉为食药两用品种，具有解表、除烦、宣发郁热的功效，用于感冒，寒热头痛，烦躁胸闷，虚烦不眠。李时珍的《本草纲目》中则有“豆豉具开胃增食、消食化滞、发汗解表、除烦喘等疗效”的记载。药用与食用淡豆豉有别，药用淡豆豉，大豆100kg，需用桑叶、青篙各7kg～10kg的煎液浸泡吸尽；而食用淡豆豉无此要求。从形态上来看，大多数豆豉为完整的发酵豆，但也有呈豆瓣状的；以加工原料来分，可分为黄豆豆豉和黑豆豆豉2类；根据口味又可分为淡豆豉、咸豆豉和酒豆豉3类。淡豆豉又称家常豆豉，是将煮熟的黄豆或黑豆经自然发酵而成的。咸豆豉是将煮熟的大豆，先经制曲，再添加食盐、白酒、辣椒、生姜等香辛料，入缸发酵晒制而成的，含盐量一般高于8％。将咸豆豉浸于黄酒中数日，取出晒干，即制得酒豆豉；根据发酵微生物来分类，豆豉可分为毛霉型豆豉、曲霉型豆豉、根霉型豆豉和细菌型豆豉4类；按成品水分含量多少，可分为干豆豉、湿豆豉和水豆豉3类。

4、通常(淡)豆豉的发酵是多种微生物共同作用的结果，除了主要微生物外，都还伴随着其他次要微生物的生长。在制曲及后发酵过程中，基本上都包括霉菌、细菌和酵母菌等微生物的参与。但在不同的开放环境中，会形成不同的微生物区系，也决定了其酶系的多样性，产生更为丰富多样的代谢产物。目前，已确定的淡豆豉发酵菌株包括黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、毛霉(mucor)，根霉(rhizopus)、豆豉芽孢杆菌(lobster saucesubtilis)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、乳酸菌(lactic acid bacteria)及微球菌(micrococcus)等。国内外对豆豉发酵微生物的研究情况见下表。

5、

6、淡豆豉的制造历史悠久，加工方法以蒸制和发酵为主。豆豉种类繁多，酿造工艺复杂，但主要分为前处理(即原料处理)、制曲及后发酵3个阶段。目前，我国所产淡豆豉由于各地环境、气候、用途、发酵方法差异而有所不同，并且大豆在发酵的过程中受菌种、温度、湿度、酸度等因素影响较大。

7、目前临床上使用的药用淡豆豉是按《中华人民共和国药典》2010年版一部制法加工而成，炮制工艺为：取桑叶、青蒿各70g～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，吸尽煎液后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖，闷使发酵至黄衣上遍时，取出，除去药渣，洗净，置容器内再闷15d～20d，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即得药用淡豆豉。

8、各种微生物发酵制备豆豉的工艺总结如下：

9、(1)毛霉型豆豉发酵工艺

10、毛霉型豆豉在全国同类产品中产量最大，是四川的特产，主要以永川豆豉及潼川豆豉为代表。因其醇香浓郁，富于酯香，成品油润化渣，深受人们喜爱。毛霉生长要求的温度比较低，制曲时间长，在我国的很多地方都不适合生产毛霉豆豉。毛霉型豆豉生产主要工艺流程：

11、黑豆(黄豆)→筛选→洗涤→浸泡→沥干→蒸煮→冷却→接种→制曲→洗曲→添加辅料(拌盐等)→后发酵(6℃，10～12月)→包装→杀菌→成品。

12、接种的毛霉菌种一般是总状毛霉(mucor racemosus)，兼有纤维酶活力高的其他霉菌和少量细菌。制曲时间一般为10d～20d，入房温度为2℃～6℃，品温为5℃～15℃，入室3d～5d豆粒可见白色霉点，8d～12d菌丝生长整齐，且有少量褐色孢子生成，16d～20d毛霉转老，菌丝由白色转为灰色时即可下架。

13、洗曲时将发酵成熟的成曲打散成颗粒状，倒入盆中，以干黄豆计，每50kg干豆加盐9kg，白酒0.5kg，水0.5kg～2.5kg混合均匀，并用手搓，尽量去掉孢子和菌丝，否则生产出来的产品颜色不纯，带有强烈的苦涩味和霉味，而且晾晒后外观较差。

14、(2)曲霉型豆豉发酵工艺

15、曲霉型豆豉起源最早且分布最广，在国内以广东阳江豆豉和湖南浏阳豆豉最出名。米曲霉型豆豉主要菌种是米曲霉as3.951、as3.042，纯种米曲霉制豉法则是通过接种培养的米曲霉孢子来发酵。在曲霉型豆豉生产制作的过程中，米曲霉产生中性及碱性蛋白酶能力比较强，酸性蛋白酶活力较低。米曲霉发酵完成制曲后加入一定的食盐、醪糟、蒸馏酒等后发酵，产品一般以咸豆豉的形式出现，主要用于加工风味豆豉等调味品。曲霉型豆豉生产主要工艺流程：精选大豆→浸泡(40℃、2h)→蒸煮(121℃、30min)→冷却→接种(米曲霉、黑曲霉等)→制曲→洗曲→添加辅料(拌盐)→后发酵→包装→杀菌→成品。

16、(3)根霉型豆豉发酵工艺

17、根霉型豆豉代表产品是丹贝，是印度尼西亚、马来西亚和泰国等东南亚地区人民广泛作为主食的一种大豆发酵食品。其主要发酵微生物为米根霉(rhizopus oryze)、少孢根霉(rhizopus oligosporus)和毛霉(mucor indicus)。因为东南亚地区常年气温在20℃～30℃，最适宜根霉菌生长，但是根霉菌不具备分解大豆外皮的酶系，只有在去皮的大豆上才能生长良好。所以，丹贝生产中有一个去皮的工序。丹贝的生产主要采用无盐固态法进行发酵，发酵周期比较短。传统的丹贝生产流程：精选大豆→浸泡→去皮→水煮→沥水→冷却摊凉并用香蕉叶或其他叶片覆盖→发酵(1d～2d)→成熟→成品。

18、因自然发酵不容易控制，易滋生杂菌腐败。纯种发酵目前主要以少孢根霉作为丹贝生产的菌种，并添加乳酸或接种乳酸菌酸化，使ph值降低抑制杂菌生长。现代丹贝的生产工艺：精选大豆→浸泡→酸化基质(加1％乳酸)→去皮→蒸煮(121℃高压蒸10min)→沥水→冷却→接种(少孢根霉)→拌匀→分装→恒温培养(36±1)℃、30h)→成熟→成品。

19、(4)细菌型豆豉发酵工艺

20、细菌型豆豉主要是云南、贵州、山东一带民间制作的家常豆豉，除山东水豉外，大都家庭都能制作食用。细菌豆豉以日本研究较多，目前，用于豆豉发酵最多的枯草芽孢杆菌为纳豆型枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)，是日本细菌型豆豉“纳豆”的主要作用菌，在较高温度下，使之繁殖于蒸熟大豆上，借助其较强的蛋白酶系生产出风味独特的豆豉。细菌型豆豉(纳豆)生产工艺流程：精选大豆→流水浸泡14h→蒸煮(130℃、55min)→接种发酵(40℃、95％相对湿度)→发酵纳豆保熟(5℃、24h)→成熟→纳豆。

21、在制作细菌型豆豉时，将水煮后的大豆捞出，沥去余水，趁热用麻袋包裹，加覆盖物保温培养，在高温高湿的环境中，大多数微生物生长受到抑制，枯草杆菌却能迅速繁殖，培养2d后，豆粒上布满黏液、可牵拉成丝并有特殊臭味时，即可加入盐、白酒和香料等，发酵5d～7d即成为水豆豉。我国细菌型豆豉生产工艺流程：精选大豆→浸泡→水煮→捞出→沥水→趁热用麻袋包裹→高温制曲(2d)→加入盐、白酒和香料→发酵(5d～7d)→水豆豉。

22、(5)豆豉多菌种发酵工艺

23、传统天然制曲方法加工的豆豉，虽然豉味丰满，但受气候条件制约，发酵周期长、产量低；而单一菌种加工豆豉的风味欠丰满，还容易腐败发臭。因此，人们采用多菌种制曲，所产豆豉香气浓郁，营养丰富，味道鲜美，口感细腻无渣，发酵周期可由传统的1年以上缩短到2～3月左右。近年来人们开始研究豆豉的多菌种发酵工艺。

24、在现代研制的中成药中，淡豆豉多与其他药物配伍，用于治疗感冒、痢疾及恶疮等疾病。明朝的《本草纲目》中记载：“诜曰：陕府豉汁，甚胜常豉。其法以大豆为黄蒸，每一斗，加盐四升，椒四两，春三日、夏二日、冬五日即成。半熟加生姜五两，既洁净且精也。时珍曰：豉，诸大豆皆可为之，以黑豆者入药。有淡豉、咸豉，治病多用淡豉汁及咸者，当随方法。其豉心乃合豉时取其中心者，非剥皮取心也。此说见外台秘要。

25、造淡豉法：用黑大豆二三斗，六月内淘净，水浸一宿沥干，蒸熟取出摊席上，候微温篙覆。每三日一看，候黄衣上遍，不可太过。取晒簸净，以水拌干湿得所，以汁出指间为准。安瓮中，筑实，桑叶盖厚三寸，密封泥，于日中晒七日，取出，曝一时，又以水拌入瓮。如此七次，再蒸过，摊去火气，瓮收筑封即成矣。

26、造咸豉法：用大豆一斗，水浸三日，淘蒸摊罯，候上黄取出簸净，水淘晒干。每四斤，入盐一斤，姜丝半斤，椒、橘、苏、茴、杏仁拌匀，入瓮。上面水浸过一寸，以叶盖封口，晒一月乃成也。造豉汁法：十月至正月，用好豉三斗，清麻油熬令烟断，以一升拌豉蒸过，摊冷晒干，拌再蒸，凡三遍。以白盐一斗捣和，以汤淋汁三四斗，入净釜。下椒、姜、葱、橘丝同煎，三分减一，贮于不津器中，香美绝胜也。有麸鼓、瓜豉、酱豉诸品皆可为之，但充食品，不入药用也。”

27、在汉代已经有其作为药用的明确记载，淡豆豉有解表、除烦、宣发郁热的功效，临床上常内服用于治疗感冒、胸中烦闷、热郁头痛等。

28、淡豆豉的主要成分有蛋白质，脂肪，维生素b1、维生素b2，多糖，大豆异黄酮，其中大豆异黄酮、皂苷、蛋白、γ-氨基丁酸、低聚糖、豆豉纤溶酶和一些挥发性化合物为主要的活性物质，异黄酮作为淡豆豉中对人体起非常重要调节作用的成分，分为游离型苷元类以及结合型糖苷类。

29、中国专利cn 104073444b，公开了一种米曲霉tjtsw001及其在中药淡豆豉发酵中的应用，该米曲霉于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.8945。该米曲霉菌种为从淡豆豉中分离，经钴-60和紫外诱变筛选得到。该菌种可将大豆异黄酮水解为大豆苷元和糖类。本发明的菌株在中药淡豆豉发酵生产中能够发挥重要作用，可以获得具有高含量大豆苷元的淡豆豉，从而可以增加其功效性，具有广泛的应用前景。

30、大豆异黄酮在大豆中，主要有两种存在形式，一种为游离型苷元，包括染料木素(又称大豆苷元，金雀异黄素)和黄豆苷，另一种为结合型的糖苷。糖苷主要以丙二酰染料木素，丙二酰大豆苷，染料木苷，大豆苷的形式存在。大豆中主要以结合型的糖苷为主，游离的苷元占比相当少，约占总量的2％～3％。需要指出的是，苷元的活性要远高于糖苷。结合型的糖苷需要水解成苷元才能发挥作用。因此，如果能将糖苷水解成苷元的形式，将获得更高的生理活性。因此，获得更高活性的大豆异黄酮苷元，对提高淡豆豉的药效有十分显著的现实意义。

技术实现思路

1、申请人对米曲霉tjtsw001的发酵炮制淡豆豉的工艺做了更为深入的研究，研究中发现，通过调节发酵环境中氨态氮的含量，可以进一步提高所制备淡豆豉中大豆异黄酮苷元的含量。并且有效提高其解热作用。

2、本技术首先公开一种基于调节发酵环境氨态氮含量的淡豆豉的发酵炮制方法。

3、所述发酵炮制方法由以下步骤组成：

4、步骤1)挑选成熟、颗粒饱满均匀、无损伤霉变的新鲜黑豆，用清水快速冲洗，除去浮土及杂质，并蒸熟；

5、步骤2)取米曲霉tjtsw001种于斜面试管中，于35℃下，培养5d，待长好后，然后用无菌水洗下表面孢子，将其接种于液态培养基中，液态培养基为含有质量分数为6％的黄豆粉以及谷氨酸的纯化水，体积为20ml。在35℃，180rpm下培养3天。将其作为液态种。

6、步骤3)取桑叶、青蒿，加水煎煮，煎煮3次，合并滤液；

7、步骤4)将步骤1)所得黑豆浸泡其中，直至药汁完全吸干为止。然后蒸熟，待其冷却到室温后，将上述液态种拌入其中，在其上覆盖4层纱布，以保持水分。

8、步骤5)待步骤4)黑大豆表面布满“黄衣”后，取出置于密闭容器内，在50℃下，发酵15-20天；

9、步骤6)在步骤5)的密闭容器中，取出黑大豆，蒸30分钟，然后干燥，即得。

10、其特征在于，所述步骤2)中，液态种含有米曲霉tjtsw0013×106-4×106cfu/ml。

11、步骤2)中，加入谷氨酸的质量百分比为1％-10％。

12、步骤2)中，加入谷氨酸的质量百分比为2％。

13、步骤3)和步骤4)中桑叶，青蒿和黑豆的质量比为1:1:10。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

15、本技术提供一种基于调节发酵环境氨态氮含量的淡豆豉发酵炮制方法。以米曲霉tjtsw001为发酵菌株，通过在其培养环境中加入谷氨酸的方式，引入氨态氮。与未加入谷氨酸的发酵方法相比，所制备的淡豆豉样品大豆异黄酮苷元含量得到显著提升，并且其退热作用同样得到提升。

16、本技术最后提供一种淡豆豉，由前述的淡豆豉发酵工艺制得。