一种检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法与流程

本发明属于生物医学，尤其适用于检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法。

背景技术：

1、表皮内含有大量神经纤维，这些纤维均为小直径有髓纤维和无髓纤维，神经纤维根据直径大小和功能的不同通常被分为aα、aβ、aγ、aδ和c型纤维，后两者直径分别为1～5μm、和0.3～1.3μm，即通常所说的小纤维神经，很多周围神经疾病从早期即会在皮肤表皮内的神经纤维上出现相应改变。

2、小纤维神经病(smal l fiber neuropathy,sfn)是指以aδ和无髓纤维c型纤维受损为特征的一类疾病，可引起感觉和自主神经功能障碍。临床上单独的自主神经病较少见，疼痛等感觉症状往往比自主神经症状常见。因此，sfn通常又被称为“痛性周围神经病”。这类小纤维神经病多为自发性，虽然临床常规检查以及神经电生理学测试通常正常，但可以通过皮肤活检技术定量检测表皮神经纤维密度。目前，皮肤活检是评估小纤维感觉神经病应用最多、最可靠的小纤维功能评估方法。活检标本经过冰冻包埋、冰冻切片、免疫组织化学染色等过程，在光学显微镜下观察并计数表皮小纤维神经密度。

3、组织透明化技术是应用水溶性有机溶剂或者亲水性试剂，对固定组织通过浸泡、电泳或灌注等方式进行透明化处理，然后应用高折射率介质匹配组织折射率，降低光散射，使组织达到光学透明，进而增加成像深度和图像对比度的技术。由于传统方法只是在某一个或几个皮肤横断面观察小纤维神经密度，在组织复杂、病变程度不一致的情况下，易出现二维平面下重复计数、计数不足的问题，导致局部组织内的小纤维神经密度，不足以客观评估整个活检标本的病变程度。因此，组织透明化后在三维立体层面进行疾病状态的客观评估就显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术中评估客观性差的不足，而提供一种基于组织透明化技术和免疫荧光染色技术，包括以下步骤来实现。

2、一种检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法，其特征在于，包括以下试剂：用于组织透明化的试剂、用于检测pgp9.5的试剂，所述pgp9.5为蛋白基因产物9.5；

3、进一步地，所述用于组织透明化的试剂，包括包括固定液、透明液cubic-l、透明液cubic-r+、透化成像液；

4、进一步地，所述固定液为含有4％多聚甲醛的pbs溶液；

5、进一步地，所述透明液cubic-l为含有正丁基二乙醇胺和triton x-100的水溶液，所述透明液cubic-r+为含有45％安替比林、30％烟酰胺和0.5％正丁基二乙醇胺的水溶液；

6、进一步地，所述透化成像液包括成像液为含有60％苯甲基有机硅油和40％矿物油的溶液；

7、进一步地，检测pgp9.5的试剂包括pgp9.5一抗为鼠单克隆抗体，使用的浓度为1:500，还包括荧光素标记的pgp9.5二抗为荧光素alexa fluro 488(绿)标记的驴抗鼠二抗，驴抗鼠二抗使用的浓度为1:300；

8、本发明所述一种检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法，包括以下步骤：

9、1)皮肤组织透明化，将皮肤组织浸泡于固定液中，4℃摇床孵育8～10小时；

10、2)将上述皮肤组织用pbs清洗3次，每次2小时，之后将皮肤浸入50％cubic-l水溶液中，37°摇床孵育8～10小时；

11、3)取出皮肤组织，重新浸入cubic-l溶液中，37°摇床孵育3天，每24小时换液一次；

12、4)将透明化皮肤组织荧光染色，具体方法为将步骤3皮肤组织用pbs清洗3次，每次2小时，之后将皮肤组织浸入pgp9.5一抗中，在37°条件下摇床孵育2天；

13、5)将步骤4皮肤组织用pbs清洗3次，每次2小时，之后将皮肤组织浸入荧光素标记的pgp9.5二抗中，在无光照37°条件下摇床孵育2天；

14、6)将步骤5皮肤组织用pbs清洗3次，每次2小时，之后将皮肤组织浸入25％固定液中，室温摇床孵育8～10小时；

15、7)将步骤6皮肤组织用pbs清洗3次，每次2小时，之后将皮肤组织浸入50％ cubic-r+水溶液中，37°摇床孵育8～10小时；

16、8)将步骤7得到的皮肤组织，重新浸入cubic-r+溶液中，在37°条件下摇床孵育2天，每24小时更换一次溶液；

17、9)将步骤8皮肤组织放入成像液中适应1小时后，在leica激光共聚焦显微镜下观察并摄像，观察皮肤组织pgp9.5在真皮表皮交界区的分布；

18、本发明提供一种基于组织透明化技术和免疫荧光染色用于检测皮肤小纤维神经密度的技术方法，经过此方法处理的皮肤组织通过断层扫描后可进行三维重建，从而客观、全面、准确评估患者皮肤小纤维神经密度，为临床小纤维神经病变相关疾病诊疗提供参考依据。

技术特征：

1.一种检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法，其特征在于，包括以下试剂：用于组织透明化的试剂、用于检测pgp9.5的试剂，所述pgp9.5为蛋白基因产物9.5。

2.如权利要求1所述的一种基于透明化和免疫荧光检测皮肤小纤维神经的试剂盒，其特征在于，所述用于组织透明化的试剂，包括包括固定液、透明液cubic-l、透明液cubic-r+、透化成像液。

3.如权利要求2所述的一种基于透明化和免疫荧光检测皮肤小纤维神经的试剂盒，其特征在于，所述固定液为含有4％多聚甲醛的pbs溶液。

4.如权利要求2所述的一种基于透明化和免疫荧光检测皮肤小纤维神经的试剂盒，其特征在于，所述透明液cubic-l为含有正丁基二乙醇胺和triton x-100的水溶液，所述透明液cubic-r+为含有45％安替比林、30％烟酰胺和0.5％正丁基二乙醇胺的水溶液。

5.如权利要求2所述的一种基于透明化和免疫荧光检测皮肤小纤维神经的试剂盒，其特征在于，所述透化成像液包括成像液为含有60％苯甲基有机硅油和40％矿物油的溶液。

6.如权利要求1所述的一种基于透明化和免疫荧光检测皮肤小纤维神经的试剂盒，其特征在于，检测pgp9.5的试剂包括pgp9.5一抗为鼠单克隆抗体，使用的浓度为1:500，还包括荧光素标记的pgp9.5二抗为荧光素alexa fluro488(绿)标记的驴抗鼠二抗，驴抗鼠二抗使用的浓度为1:300。

7.一种检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种检测皮肤小纤维神经的试剂盒及方法，包括以下试剂及检测方法：用于组织透明化的试剂、用于检测PGP9.5的试剂、透化成像的试剂、组织透明化方法及免疫荧光染色方法，所述PGP9.5为蛋白基因产物9.5。经过此方法处理的皮肤组织通过断层扫描后可进行三维重建，从而客观、全面、准确评估患者皮肤小纤维神经密度，为临床小纤维神经病变相关疾病诊疗提供参考依据。技术研发人员：孙维梁,汪伟,高艳香,郭静,张雨婷受保护的技术使用者：中日友好医院（中日友好临床医学研究所）技术研发日：技术公布日：2024/8/1