一种级联酶有序固定方法及在亚硝酸盐可视检测中的应用

本发明属于天然酶固定化与生物传感器，具体涉及级联反应的葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)在蛋白-无机杂化纳米花(decn)中有序固定的新方法，并将其包封在水凝胶中构建便携化的亚硝酸盐可视检测传感器。

背景技术：

1、基于生物酶构建的传感器在医学诊断、环境监测和食药检测等方面有广泛的应用和研究。生物酶的高活性和特异性为开发优质性能的生物传感器提供了保障。但是，由于生物酶的蛋白质本质，其在苛刻条件下(高温、极端ph和有机溶剂等)极易发生空间构象的变化，导致活性丧失，这极大地阻碍了酶基生物传感器的产业化发展。

2、固定化酶技术为生物酶的工业化生产提供可靠技术，通过将酶束缚或限制在固体材料一定区域内，既保留酶原有催化活性，又可提升酶对环境的抵抗性，同时，固定化酶的非均相性使其便于后续的产物分离操作，提高酶的循环使用次数。蛋白无机杂化纳米结构是一种花状的纳米材料，具有较高的比表面积、强大的吸附能力、优异的催化性能和高效的负载能力，是天然酶固定化的良好载体。通过温和的生物矿化自组装方式，使天然酶固定于无机盐形成的骨架中，可以限制蛋白结构构象，提高酶的催化效率和稳定性。但是，在当前的基于蛋白无机杂化纳米结构固定酶的策略中，往往是固定单一酶，或者是多酶杂乱混合固定。混合无序的固定方式不利于级联酶反应时中间产物的流窜，因此会阻碍级联酶各自优势的最佳利用，导致其利用率低。所以必须研究级联酶固定化的最佳方式，以满足中间产物的顺利流窜和高效利用，同时提高酶的整体催化效率和稳定性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种级联酶gox和hrp的有序固定化方法，并构建基于gox@hrpdecn的传感器检测亚硝酸盐。

2、本发明通过生物矿化自组装方法，使gox先固定于磷酸铜骨架上形成花状结构goxdecn，待其生长到一定的程度后，引入的hrp与goxdecn通过静电吸附作用搭载在其表面，形成分层的级联酶花状纳米结构gox@hrp decn。由于在gox@hrp decn中级联酶分层有序，为中间产物的运输提供了特定路线，酶的催化效率和利用率进一步提高。decn也对生物大分子起到保护作用，固定在其中的酶较天然酶，在不适宜、极端环境中表现出更好的稳定性。借助gox@hrp edcn优异的催化活性和稳定性，构建[gox@hrp decn+葡萄糖+3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)]反应体系检测亚硝酸盐。进一步将gox@hrp decn封装于具有固定和保护作用的多孔网络结构水凝胶中，在增强其稳定性和便携化的同时，实现智能手机拍照后的图像输出。将水凝胶的多彩图像转化为色坐标数据信息准确定量检测亚硝酸盐，为亚硝酸盐的现场便携化检测提供了技术支撑。

3、本发明所述的级联反应酶gox和hrp的有序固定化方法及其用于亚硝酸盐检测的步骤如下：

4、a、gox@hrpdecn的制备：

5、将gox(8mg/ml)、pbs缓冲液(10mmol/l、ph＝7.4)和cuso4·5h2o(0.2mol/l)按照体积比10：87：3，在2.0ml离心管中混合3～5min，随后在4℃条件下静置12～15小时。通过在2000～3000rpm下离心1～3min，除去上清液之后，按照体积比9：1加入pbs缓冲液(10mmol/l、ph＝7.4)和hrp(12mg/ml)复溶，在4℃下静置12～15小时。再在2000～3000rpm下离心1～3min后，除去上清液，并用去离子水洗涤1～2次，以去除多余的蛋白。将得到的gox@hrpdecn复溶于pbs缓冲液(10mmol/l、ph＝7.4)制备浓度为0.04mg/ml的固定化酶材料，4℃储存备用。

6、b、比色传感平台构建及“a652nm/a455nm-亚硝酸钠浓度”的标准关系曲线绘制

7、将干燥至恒重的亚硝酸钠用超纯水溶解配置不同浓度的亚硝酸钠溶液(0.008、0.01、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8mmol/l)。将gox@hrp decn(0.04mg/ml)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(10mmol/l，ph＝4.5)、葡萄糖水溶液(40mmol/l)、tmb溶液(1mmol/l)、超纯水和不同浓度的亚硝酸钠溶液按照比例体积比5：5：5：2：3：5混合均匀，在25℃下孵育20～40min，用紫外分光光度计检测652nm和455nm处的吸光度值，将652nm处的吸光度值(a652nm)和455nm处的吸光度值(a455nm)做比(a652nm/a455nm)，即可获得不同浓度亚硝酸钠对应的a652nm/a455nm数值，从而建立“a652nm/a455nm-亚硝酸钠浓度”的标准关系曲线。

8、c、包封gox@hrp decn的琼脂糖水凝胶的制备：

9、配置10mg/ml的琼脂糖水溶液，80～95℃加热至完全溶解为均匀的液态。将gox@hrp decn(0.04mg/ml)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(10mmol/l，ph＝4.5)和琼脂糖水溶液(10mg/ml)以5：5：13的体积比混匀，放置于室温下形成固态凝胶备用。

10、d、基于水凝胶的传感平台构建及“色坐标(r/g)－亚硝酸盐浓度”的标准关系曲线绘制

11、将干燥至恒重的亚硝酸钠用超纯水溶解配置不同浓度的亚硝酸钠溶液(0.1、0.4、0.8、1、1.4、1.8、2、2.5、3、3.5、4mmol/l)。将包封有gox@hrpdecn和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的琼脂糖水凝胶、葡萄糖水溶液(40mmol/l)、tmb溶液(2mmol/l)和不同浓度的亚硝酸钠溶液按照体积比23：5：2：20混合。在25℃下反应40～70min后，利用自制拍照暗箱，通过智能手机采集图像。使用商业软件image j直接分析图像的色坐标(包括红色通道r、绿色通道g和蓝色通道b)，即可获得不度亚硝酸钠浓度对应的色坐标，通过红色通道的色坐标值/绿色通道的色坐标值(r/g)对数据进行处理，从而建立“r/g-亚硝酸钠浓度”的标准关系曲线。

12、e、实际样品的检测

13、将新鲜的大白菜洗净、晾干、切碎制成匀浆备用。将市售酸菜沥干水分后切碎制成匀浆备用。分别称取5g(精确至0.001g)上述匀浆试样，置于具塞锥形瓶中，将饱和硼砂溶液(50g/l)和70℃左右的水按照体积比1：12混匀，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。将上述混合溶液、亚铁氰化钾溶液(106g/l)、乙酸锌溶液(220g/l)和水按照体积比65：4：11混合摇匀，以沉淀蛋白质。摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去一定体积的初滤液，滤液备用。对于酸菜汁，称取试样90g(精确至0.001g)，置于具塞锥形瓶中，将饱和硼砂溶液(50g/l)和70℃左右的水按照体积比1：12混匀，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。将上述混合溶液、亚铁氰化钾溶液(106g/l)、乙酸锌溶液(220g/l)和水按照体积比65：4：11混合摇匀，以沉淀蛋白质。摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去一定体积的初滤液，滤液备用。之后用上述实际样品溶液将亚硝酸钠标准品溶解稀释为0、0.2和0.8mmol/l，测定按照步骤d，并使用步骤d所述色坐标值分析方法，获得对应的r/g值，带入步骤d获得的“r/g-亚硝酸钠浓度”标准关系曲线，即可计算得到实际样品中的亚硝酸盐浓度，从而分析得出用此方法得到的亚硝酸盐在实际样品中的加标回收率。

14、本发明的机理如下：

15、本发明通过温和的生物矿化自组装方法，使gox先固定于磷酸铜骨架上形成花状结构gox decn，待其生长到一定的程度后，引入的hrp与gox decn通过静电吸附作用搭载在其表面，形成分层的级联酶花状纳米结构gox@hrp decn，进而构建[gox@hrp decn+葡萄糖+tmb]反应体系。加入的葡萄糖小分子进入纳米结构内部，首先在gox的催化下生成过氧化氢(h2o2)和葡萄糖酸，h2o2在由内向外扩散的过程中与hrp共同作用使加入的无色tmb转化为蓝色的氧化态tmb。加入亚硝酸盐后，与蓝色的氧化态tmb选择性地反应生成黄色重氮化的氧化态tmb。用紫外分光光度计扫描光谱可以观察到，在652nm处的吸收峰峰值下降，455nm处的峰值上升。通过将652nm和455nm处的吸光度值做比(a652nm/a455nm)，建立“a652nm/a455nm-亚硝酸盐浓度”的标准曲线，增强了信号强度和准确度。由于反应结果呈现丰富的色彩变化，进一步将gox@hrp decn封装在琼脂糖水凝胶中，制成显色水凝胶，该水凝胶兼有酶级联反应、快速颜色响应和抗外界因素干扰能力强的特点，通过稳定的信号输出和防污性能提高传感灵敏度。结合智能手机组成的自制便携式拍照设备和image j软件分析，可直接获得不同浓度亚硝酸盐对应的色坐标，建立“r/g-亚硝酸盐浓度”的标准曲线。对于未知浓度的亚硝酸盐溶液，将其进行相同操作得到的r/g值带入该标准曲线，即可计算得出未知溶液的亚硝酸盐浓度，从而实现食品中亚硝酸盐的检测。

16、本发明所提出的级联反应酶在decn中的有序、分层化固定方法有效的提高了天然酶的利用效率和稳定性。基于gox@hrp decn构建的液相传感器在1.6～360μmol/l亚硝酸盐浓度范围内表现出良好的线性关系，构建的水凝胶传感器的线性范围为40～1600μmol/l，两者具有高的选择性和抗干扰能力。水凝胶传感平台简化了操作步骤，降低了试剂消耗，实现了去仪器化检测，为现场检测食品中的亚硝酸盐提供了新思路和技术支撑。

17、与现有的技术相比，本发明具有以下特点：

18、(1)通过温和的生物矿化自组装方式将级联反应酶gox和hrp有序固定在decn结构中，有效提高了天然酶的催化效率和稳定性，为级联酶有序、高效固定提供了一种新方法。

19、(2)使用水凝胶封装花状材料gox@hrp decn，为其提供了惰性环境并有效抵抗其他大分子的干扰，进一步提高天然酶的温度稳定性和储存稳定性，这对现场和工业化应用极其有利。

20、(3)基于gox@hrp decn的水凝胶传感器，通过智能手机采集图像后进行分析，实现了去仪器化检测，为亚硝酸盐现场便携式检测提供了技术支撑。