器官移植排斥风险检测方法及检测用分子标志物与流程

本发明涉及生物基因检测，具体为器官移植排斥风险检测方法及检测用分子标志物。

背景技术：

1、器官移植是临床上广泛应用于治疗终末端器官衰竭的一种有效治疗方案，截至2023年，我国已完成器官移植手术达17141例，其中肾移植10734例，肝移植5123例，肺移植688例，心脏移植596例。然而器官移植术后面临的免疫排斥反应是威胁移植术后患者长期健康和移植物存活的主要风险之一。因此，及时在早期有效监测并发现排斥风险是目前的研究热点。

2、当前的器官移植排斥反应检测以活体穿刺(b iospy)作为移植物排斥反应的检测“金标准”，然而通过穿刺检查患者排斥风险会导致病人依从性差、二次损伤等风险；依赖血清肌酐和dsa等指标虽然可以解决活体穿刺所存在的问题，但对排斥检测的诊断灵敏度和特异性均无法完全满足临床早期筛查要求，因此需要建立一种排斥筛查方法可以满足无创、精准且可进行实时监测的临床要求。

3、目前主要基于snp分型进行ddcfdna定量的检测技术为数字微滴pcr(drop l et digita l pcr,ddpcr)以及二代高通量检测技术。ddpcr可以通过在微滴中实现单目标分子扩增，并依靠泊松分布原理，实现对目标分子浓度的绝对定量，可以在样品低起始量下实现高精度定量分析，但ddpcr通量较低，无法同时进行大量样品的定量检测、检测周期较长、试剂耗材成本高，并且在低样本起始量下的检测灵敏度不理想。

4、另一方面,snps位点通常以单核苷酸的替换或转变为主，容易在ngs文库构建和测序过程中引入pcr扩增错误，外源基因组污染，测序背景噪音等系统性错误，而插入/缺失(inde l)多态性位点作为一种特殊的snp多态位点，同样可以满足在ngs测序中对ddcfdna分型识别并且定量的要求，并且由于i nde l位点在基因分型差异上表现为数个以上碱基的插入/缺失，因此在测序信号识别上具有更高的识别度，一定程度上避免了定量结果的系统错误干扰。

5、本发明提出器官移植排斥风险检测方法及检测用分子标志物，解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明通过选择人类基因组上的i nde l多态位点作为基因分型标志物，通过mpcr扩增建库方法进行位点信息捕获，实现基于ddcfdna二代测序定量检测的排斥监测方法。

2、器官移植排斥风险检测方法，将人类基因组中相对受体cfdna中插入/缺失的inde l多态性位点作为基因分型标志物，对器官移植供体和受体的cfdna进行分型和频率统计，定量分析，根据定量分析结果评估受体对供体的排斥风险。具体如下：

3、器官移植排斥风险检测用分子标志物，包括：由一个或多个有效i nde l位点组成的检测pane l，所述有效i nde l位点定义为经筛选得到的人类基因组中可区分受体、供体的i nde l位点，受体在有效i nde l位点处的基因型为纯合子。

4、在后期定量检测过程中，根据二项分布概率模型统计与纯合受体基因型不一致的信号值(测序读段reads或者覆盖counts数量)计算得到以该有效i nde l位点为检测点的供体相对含量，用于判别受体接受器官移植的风险。

5、优选的，所述器官移植排斥风险检测用分子标志物，所述有效i nde l位点选自受体血液或尿液中的cfdna。

6、优选的，所述器官移植排斥风险检测用分子标志物，获取步骤如下：

7、提取获得血液或尿液中的cfdna；

8、根据i nde l位点上下游序列设计pcr引物并通过多重pcr(mpcr)延伸目标区域对靶标区域进行文库构建预捕获；

9、对mpcr中预捕获后纯化产物进行二轮pcr，获得用于测序的dna文库；

10、测序、对受体i nde l位点进行分型，筛选出纯合受体i nde l位点，根据纯合受体i nde l位点推断供体基因型，得到所有有效i nde l位点；

11、选取部分或全部有效i nde l位点作为分子标志物。

12、器官移植排斥风险检测方法，检测步骤如下：

13、s1、采集检测对象血液或尿液或体液样本，提取获得血液或尿液或体液cfdna；s2、通过mpcr扩增对cfdna上i nde l靶标位点进行区域预捕获；

14、s3、测序文库构建，对cfdna预扩增产物进行pcr引入接头和样品条码，获得cfdna测序文库，进行测序；

15、s4、将下机测序的原始数据进行质控和数据过滤，将测序读段进行人类参考基因组比对识别并统计i nde l位点读段数，对受体i nde l位点进行分型，筛选纯合受体i ndel位点，用于推断供体基因型，并根据i nde l基因型判断结果选择有效i nde l位点(即上文所述的检测用分子标志物)；

16、s5、将有效cfdna文库中部分或全部有效i nde l位点用于ddcfdna定量，将用于定量检测的有效i nde l位点中与纯合受体基因型不一致的读段信号除以总读段信号值，为该i nde l位点计算的到ddcfdna相对含量；

17、s6、定量结果评估，根据本次数据结果的测序平均深度、覆盖度以及有效i nde l位点个数评估测序定量结果。

18、优选的，所述器官移植排斥风险检测方法，步骤s5中用于定量检测的有效i nde l位点选取部分扩增效率较为均一的部分有效i nde l位点。

19、检测用pane l尽可能容纳更多的i nde l位点(基因中的特定检测位置)，以提高检测结果的准确性以及稳定性，但同时也要考虑mpcr反应体系稳定性、扩增均一性，以及整体p l ex-pane l的设计难度，选择合适的有效i nde l位点数量进行数据统计检测。

20、优选的，所述器官移植排斥风险检测方法，将步骤s5检测到的ddcfdna相对含量，采用基于供体基因型的定量模型以及测序背景噪音的错误概率模型对ddcfdna浓度定量结果进行校正，在供体基因型已知情况下，采用中位数拟合线性回归计算校正实际位点定量结果；在供体基因型未知情况下根据gnomad数据库中等位基因频率信息、结合二项分布概率模型校正实际位点定量结果。

21、本发明将ddcfdna浓度定量检测数据作为受体器官移植排斥风险的评估依据，ddcfdna浓度定量检测过程中，本发明将筛选得到的有效i nde l位点或由多个有效i ndel位点组成的检测pane l作为分子标志物。

22、本发明通过mpcr扩增建库以及高通量测序技术，对器官移植患者血液/尿液提取cfdna样本进行检测，使用i nde l位点分子标记识别cfdna中受体cfdna和供体cfdna(ddcfdna)；mpcr捕获通过将所需捕获位点的扩增位点按照一定比例混合，实现单反应体系或pane l下的同步扩增，再通过二次pcr引入测序所用接头，构建测序所用文库，由于其在低浓度下更高的检测灵敏度，以及检测周期短，成本低等特点，弥补了杂交捕获上的不足，通过mpcr构建cfdna文库具有检测成本低，检测周期短，检测所需投入样本少的特点；通过inde l作为分子标记，可有效避免在pcr建库时测序读段错误等检测流程中引入的错误识别，可有效降低检测背景噪音，对ddcfdna具有更高分辨度和检测下限；同时，只需患者血液采集即可完成检测，可以实现无创、长期、实时监测的目的。

23、本发明涉及的该检测方法通过对i nde l位点进行mpcr扩增捕获以及高通量测序技术，使用几十种有效i nde l位点对ddcfdna浓度进行定量检测，并通过算法模型对ddcfdna检测结果进行校正，消除供体基因型、检测错误对ddcfdna定量造成的影响，从而让检测结果稳定、可靠、准确。