一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基及其应用

本发明涉及骨髓间充质干细胞衰老，具体一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基及其应用。

背景技术：

1、神经病理性疼痛是一种由神经损伤引起的相当顽固的疼痛，组织损伤后局部释放的炎症介质可以直接刺激和敏感化位于周围组织初级传入神经元神经纤维上的痛觉感受器，甚至在组织损伤愈合后也能持续数月至数年。

2、目前，药物和手术仍是神经病理性疼痛主要传统干预方式，但效果均不尽理想，因传统方法不能对损伤神经进行修复或促进神经再生功能。所以，研究者寻找有效途径干预神经病理性疼痛显得尤为重要。基于干细胞的修复神经损伤功能及促进神经再生的能力，可针对该病进行有效治疗，目前学术界一般认为干细胞治疗神经性疼痛的机理主要分五点，即神经修复、抗炎症、分泌营养因子、抑制氧化应激和改善微环境。

3、尽管骨髓间充质干细胞用于神经病理性疼痛的治疗潜能已得到了广泛认可，但老年供体的细胞及骨髓间充质干细胞培养过程中细胞老化，致使细胞功能下降，限制了其在临床上的应用。骨髓源性间充质干细胞经过长期细胞培养，会出现复制性衰老，复制性衰老是体外培养的细胞经过有限的分裂次数后，细胞出现增殖减慢、生长停滞、干性减退、丧失分化能力等现象。如何避免体外培养时骨髓间充质干细胞生物学特性的改变也是一个亟待解决的问题，为此我们提出一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基及培养方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基，该抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基可以抑制骨髓间充质干细胞在培养过程中发生衰老。

2、本发明的目的之二在于一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基的制备方法，步骤简单方便。

3、本发明的目的之三在于提供一种骨髓间充质干细胞，该骨髓间充质干细胞没有表现出衰老特征。

4、本发明的目的之四在于提供骨髓间充质干细胞在制备治疗神经病理性疼痛的干细胞制剂中的应用，该干细胞制剂治疗效果好，疗效确切。

5、本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

6、一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基，包括细胞基础培养基、体积分数为10％胎牛血清、质量分数为1％青霉素、质量分数为1％链霉素、芹菜素2～5ng/l、核桃仁脱脂提取物3～8ng/l、黄花草乙酸乙酯提取物2～3ng/l、甘草查尔酮d 5～8ng/l、硫氢化钠2～3ng/l、亚硒酸钠1～2ng/l、天然人参提取物2～5ng/l、裙带菜乙醇提取物3～8ng/l。

7、进一步地，所述细胞基础培养基是dmem、α-mem、f12、dmem/f12、rpmi1640、imem中的一种。

8、进一步地，所述骨髓间充质干细胞为自体骨髓间充质干细胞。

9、进一步地，所述自体骨髓间充质干细胞的制备方法如下：在患者局部麻醉情况下，从髂后上嵴采集骨髓30-50ml，分两侧采集，每侧采集三点，每点采集10ml骨髓；利用重力离心法将采集的骨髓离心后呈3层，上层为透明层，下层含有红细胞，呈现红色，中间层是有核细胞薄层，利用移液管轻轻吸取有核细胞，将重悬后的有核细胞接种到无菌培养瓶中，加入细胞培养液置于37℃、饱和湿度、5％的co2浓度的培养箱内开始原代培养，24-48小时换液；加入新细胞培养液之前利用pbs进行清洗培养瓶1-2次，当培养瓶出现清晰细胞集落(一般7天以上)，进行细胞收集并传代(p0)；细胞达到75～85％融合度时，移除瓶内培养液，用pbs清洗两次，用胰蛋白酶消化细胞后转移到无菌离心管内，离心沉淀细胞，重悬后计数，重复上述步骤开始传代(p1)培养，培养至第3代(p3)，收集细胞备用。

10、本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

11、一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基的制备方法，包括以下步骤：

12、s1.原料准备：按照所述抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基的组成，准备细胞基础培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、芹菜素、核桃仁脱脂提取物、黄花草乙酸乙酯提取物、甘草查尔酮d、硫氢化钠、亚硒酸钠、天然人参提取物、裙带菜乙醇提取物；

13、s2.原料初步混合：按照所述抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基的组成配比，将胎牛血清、青霉素、链霉素、芹菜素、核桃仁脱脂提取物、黄花草乙酸乙酯提取物、甘草查尔酮d、硫氢化钠、亚硒酸钠、天然人参提取物、裙带菜乙醇提取物加入到所述细胞基础培养基中，混合均匀，搅使其充分溶解，终浓度达到所述抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基的组成配比，得到初品培养基；

14、s3.平衡酸碱度：将步骤s2得到的初品培养基在含4-6％co2的细胞培养箱中平衡至ph值为7.4，即得所述抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基；

15、s4.灭菌：将得到的所述抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基用滤器过滤除菌，得到灭菌的所述抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基。

16、本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

17、一种骨髓间充质干细胞，采用所述的一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基培养所述骨髓间充质干细胞，培养后，得到所述骨髓间充质干细胞。

18、本发明的目的之四采用如下技术方案实现：

19、骨髓间充质干细胞在制备治疗神经病理性疼痛的干细胞制剂中的应用。

20、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

21、(1)本发明提供了一种抑制骨髓间充质干细胞衰老的培养基，芹菜素通过激活fak(focal adhesion kinase)和tgfβ信号通路，增强骨髓间充质干细胞的分化，并减少骨髓间充质干细胞随年龄逐渐衰老；核桃仁脱脂提取物含有大量类黄酮和酚类化合物，具有强的抗氧化活性，改善骨髓间充质干细胞的干性，促进分化，抑制骨髓间充质干细胞的衰老；黄花草乙酸乙酯提取物促进骨髓间充质干细胞的甲基转移酶mettl3和mettl14的表达，抑制骨髓间充质干细胞的衰老，甘草查尔酮d(licochalcone d)可能通过上调ampk介导的骨髓间充质干细胞的自噬激活来减少氧化应激诱导的衰老；硫氢化钠促进骨髓间充质干细胞的sirt3的表达，抑制骨髓间充质干细胞的衰老；亚硒酸钠通过激活nrf2信号途径，抵抗氧化应激的作用；天然人参提取物rg1可能通过p62上调和akt激活，增加p62与keap1之间的相互作用，从而激活nrf2通路，抑制骨髓间充质干细胞的衰老；裙带菜乙醇提取物同样，通过促进活性氧清除酶超氧化物歧化酶1(sod1)、超氧化物歧化酶1(sod2)和过氧化氢酶的表达，抑制氧化应激诱导的活性氧(ros)在细胞内的过度积累，改善了衰老干细胞的功能衰退，以上成分从多种作用途径抑制骨髓间充质干细胞的衰老，具有协同增加的作用。

22、(2)本发明提高的一种骨髓间充质干细胞，是由自体骨髓间充质干细胞培养得到的，与商业购买的骨髓间充质干细胞相比，自体骨髓间充质干细胞在传代和扩增过程中表现出更强的抗复制衰老的能力，并且自体骨髓间充质干细胞在制备治疗神经病理性疼痛的干细胞制剂中的应用中解决了干细胞移植中同种异体来源相关的风险。