一种抗亲环素A的卵黄抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗亲环素a的卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、cyclophilin a(亲环素a，cypa)属于肽基脯氨酰顺/反异构酶家族成员，具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性，是一种在生物界广泛存在、高度保守的蛋白质，参与蛋白质折叠、信号转导、病毒复制、细胞凋亡等生理过程。cypa是免疫抑制药物cyclosporin a(环孢菌素a，csa)在细胞内的主要受体，cypa-csa复合物与钙调磷酸酶结合后，能够抑制t细胞的活化。

2、cypa广泛分布在细胞内，在细胞生长正常的情况下，cypa一般作为胞内蛋白质存在于细胞质中，当细胞受到外界刺激(感染、肿瘤或炎症等)或处于活性氧应激状态下时，cypa会分泌到细胞外，胞外cypa(ecypa)在细胞膜外侧与跨膜蛋白cd147以配体-受体形式结合，成为一种有力的趋化因子，通过募集白细胞参与炎症的发生和发展过程，在炎症性疾病中发挥着重要作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种抗亲环素a的卵黄抗体及其制备方法和应用。

2、本发明提供了一种制备卵黄抗体的方法，包括如下步骤：用免疫原免疫雌性禽类动物，然后从雌性禽类动物的蛋中收集卵黄抗体；所述免疫原中具有cypa蛋白或cypa融合蛋白。

3、具体的，所述免疫原由蛋白成分和佐剂成分组成；所述蛋白成分为所述cypa蛋白或所述cypa融合蛋白。

4、具体的，所述佐剂成分为白油。

5、具体的，所述免疫原的制备方法为：将cypa蛋白或cypa融合蛋白用缓冲液(例如pbs缓冲液)调整蛋白浓度为0.2mg/ml，然后加入等体积白油并混匀，得到免疫原。

6、具体的，用免疫原免疫雌性禽类动物的方法为：对雌性禽类动物依次进行第1次免疫、第2次免疫和第3次免疫；第1次免疫和第2次免疫之间间隔14天，第2次免疫和第3次免疫之间间隔14天。

7、每次免疫的剂量为：0.5ml免疫原/羽。

8、具体的，所述免疫的方式为：肌肉注射。

9、具体的，所述免疫的方式为：腿部肌肉注射。

10、具体的，所述禽类为鸡。

11、具体的，所述禽类动物为褐壳蛋鸡。

12、具体的，所述禽类动物可为海兰褐壳蛋鸡。

13、具体的，所述雌性禽类动物的蛋为第3次免疫14天后开始连续1个月收集的蛋。

14、具体的，从雌性禽类动物的蛋中收集卵黄抗体包括如下步骤：

15、①取卵黄；

16、②将卵黄与蒸馏水混合，然后用盐酸调ph值为5.2，静置后离心收集上清液；

17、③将上清液和正辛酸溶液混匀，静置后离心收集上清液，过滤除菌，收集滤液；

18、④取滤液，超滤浓缩，得到浓缩液；

19、⑤利用分子筛层析从浓缩液中分离获得卵黄抗体。

20、具体的，从雌性禽类动物的蛋中收集卵黄抗体包括如下步骤：

21、①从蛋中取卵黄；

22、②将1体积份步骤①得到的卵黄与8份体积蒸馏水混合，然后用1m盐酸水溶液调ph值为5.2，静置12小时，然后10000rpm离心15分钟，收集上清液；

23、③将99体积份步骤②得到的上清液和1体积份98％正辛酸水溶液混匀，静置30分钟，然后10000rpm离心15分钟，收集上清液，用孔径0.22μm滤膜过滤，收集滤液；

24、④取步骤③得到的滤液，用切向流超滤膜包(截留分子量为20kd)超滤浓缩10倍，得到浓缩液；

25、⑤利用分子筛层析从浓缩液中分离获得卵黄抗体。

26、分子筛层析的层析柱：凝胶过滤层析柱superdex 200。

27、分子筛层析的步骤：上样浓缩液，然后用ph7.2的pbs缓冲液洗脱(流速为2ml/min)，收集目标峰(目标峰的判断标准：280nm波长下的紫外吸收值高于1000；洗脱过程中仅出现一个目标峰)对应的过柱后洗脱液，即为卵黄抗体溶液。

28、本发明还提供了一种制备卵黄抗体的方法，包括如下步骤：采用cypa蛋白或cypa融合蛋白作为免疫原，制备得到卵黄抗体。

29、本发明还提供了一种制备卵黄抗体的方法，包括如下步骤：采用由蛋白成分和佐剂成分组成的免疫原，制备得到卵黄抗体；所述蛋白成分为cypa蛋白或cypa融合蛋白。

30、具体的，所述佐剂成分为白油。

31、具体的，所述免疫原的制备方法为：将cypa蛋白或cypa融合蛋白用缓冲液(例如pbs缓冲液)调整蛋白浓度为0.2mg/ml，然后加入等体积白油并混匀，得到免疫原。

32、本发明还保护以上任一所述方法制备得到的卵黄抗体。

33、本发明还保护所述卵黄抗体在制备抗炎药物中的应用。

34、本发明还保护一种抗炎药物，其活性成分为所述卵黄抗体。

35、本发明还保护cypa蛋白或cypa融合蛋白在制备具有抗炎功能的卵黄抗体中的应用。

36、本发明还保护cypa蛋白或cypa融合蛋白在制备抗炎药物中的应用。

37、本发明还保护用于制备针对cypa蛋白或cypa融合蛋白的卵黄抗体的物质在制备抗炎药物中的应用。

38、具体的，所述用于制备针对cypa蛋白或cypa融合蛋白的卵黄抗体的物质为由蛋白成分和佐剂成分组成的免疫原。所述蛋白成分为cypa蛋白或cypa融合蛋白。

39、具体的，所述佐剂成分为白油。

40、具体的，所述免疫原的制备方法为：将cypa蛋白或cypa融合蛋白用缓冲液(例如pbs缓冲液)调整蛋白浓度为0.2mg/ml，然后加入等体积白油并混匀，得到免疫原。

41、以上任一所述卵黄抗体为具有抗炎功能的卵黄抗体。

42、cypa蛋白，即亲环素a。

43、具体的，所述cypa蛋白为如下(a)或(b)或(c)：

44、(a)seq id no：1所示的蛋白质；

45、(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与其具有相同功能的蛋白质。

46、(c)与(a)具有95％以上同一性且与其具有相同功能的蛋白质。

47、所述cypa融合蛋白为具有所述cypa蛋白的蛋白质。

48、所述cypa融合蛋白包括cypa蛋白和标签。

49、所述cypa融合蛋白是给cypa蛋白增加标签得到的蛋白质。

50、所述标签具体可如表1所示。

51、表1标签的序列

52、 标签 残基 序列 poly-arg 5-6(通常为5个) rrrrr poly-his 2-10(通常为6个) hhhhhh flag 8 dykddddk strep-tag ii 8 wshpqfek c-myc 10 eqkliseedl

53、具体的，所述cypa融合蛋白如seq id no：3所示。

54、具体的，所述抗炎为抑制炎症。

55、具体的，所述炎症为感染性炎症。

56、具体的，所述炎症为肺炎和/或乳房炎和/或子宫内膜炎。

57、具体的，所述药物的适应症为肺炎和/或乳房炎和/或子宫内膜炎。

58、所述肺炎具体可为肺炎链球菌引起的肺炎。

59、所述药物的适用对象为哺乳动物。

60、示例性的，所述哺乳动物为鼠、牛或猪。

61、本发明开发了抗cypa卵黄抗体，可用于抑制机体炎症反应。具体的，该抗cypa卵黄抗体针对肺炎、乳房炎、子宫内膜炎等具有良好的抑制炎症活性。